실시간 라이브 세포 분석을 통한 대식세포 기능 이해

차별화 확인. 불멸화된 THP-1 세포와 혈액 유래 일차 단핵구의 분화 중 형태학적 변화 모니터링. THP-1 세포를 48시간 동안 5 ng/mL PMA에 노출시켜 M0 대식세포로 분화시켰습니다. 원발성 단핵구는 50ng/mL GM-CSF에서 6일간 배양한 후 1ng/mL LPS + 20ng/mL IFN-γ에서 하루 더 배양하여 M1 유사 표현형으로 분화하거나 50ng/mL M-CSF에서 6일간 배양한 후 20ng/mL IL-4에서 하루 더 배양하여 M2 유사 표현형으로 분화시켰습니다. 형태는 이전 연구 결과와 일치합니다(Young et al, J Immunol, 1990). M1 집단은 계란 후라이 형태이고 M2는 계란 후라이와 방추형 세포가 혼합된 집단입니다.

차별화 추적. 위상 이미지는 큰 소포가 포함된 말기 분화된 인간 iPSC 유래 대식세포를 생성하는 분화 인간 iPSC 유래 단핵구(0~7일차)의 형태를 보여줍니다. 분화는 최소 7일 동안 유지 배지에 100ng/mL M-CSF를 추가하여 달성했습니다.
 

형태와 세포 표면 표지자를 시각화하여 분화를 연구합니다. THP-1 단핵구를 배지(미분화), 비타민 D3 또는 PMA에 노출시킨 후 CD11b, CD14 또는 CD40에 결합된 Incucyte^® Fabfluor-488 항체와 함께 노출시켰습니다. PMA는 배지 단독 또는 비타민 D3 처리 세포에 비해 세포 형태에 현저한 변화를 보였습니다(HD-위상 대비 이미지). 동역학 그래프는 다양한 처리에 따른 시간 의존적인 표면 단백질 발현의 차이를 강조합니다.

단핵구 성숙의 생물학적 중요성. 피브로넥틴으로 코팅된 ClearView 케모택시스 멤브레인 위에 순수 세포 또는 PMA 분화 M0 세포인 THP-1 세포를 시딩했습니다. 그런 다음 세포를 C5a 구배에 노출하고 Incucyte 시스템을 사용하여 매시간 이미지를 획득했습니다. 약리 반응 분석은 t=30시간에 수행했습니다. 분화된 대식세포 유사 THP-1 세포는 C5a에 대해 강한 농도 의존적 반응을 보인 반면, 분화 전의 THP-1 세포에서는 거의 또는 전혀 반응이 관찰되지 않았습니다.

대식세포 화학작용의 동역학 모니터링의 중요성. 일차 혈액 단핵구를 M2 유사 표현형으로 분화시킨 후 6일간 50ng/mL M-CSF를 투여하고 하루 더 20ng/mL IL-4를 투여했습니다. 마트리겔로 코팅된 ClearView 케모택시스 멤브레인에 대식세포를 시딩한 후 C5a 그라데이션에 노출하고 Incucyte 시스템을 사용하여 2시간마다 이미지를 획득했습니다. 4.5시간과 11시간에 바닥면 위상 분석을 수행하고 약리학적 반응을 확인했습니다. 고농도에서의 반응 지연으로 인한 상당한 시간 의존적 C5a 효능 변화, 호중구 사용 시에는 관찰되지 않았던 특정 반응에 주목합니다.

식균 작용의 정량화. iPSC-derived macrophages (Axol Bioscience) engulf Incucyte^® pHrodo^® Green E. coli Bioparticles^® in a time- and cell-number-dependent manner.  Phase contrast and fluorescence blended images of iPSC-derived macrophages in the presence 100 ug/well of pHrodo^® Green E. coli Bioparticles^® illustrate the uptake of Bioparticles^® over time.  Below each is the corresponding masked-image highlighting the use of segmentation to fully quantify the phagocytosis kinetics.  The time-course of iPSC-derived macrophage phagocytosis using a single pHrodo^® Green E. coli Bioparticle amount (100 ug/well) shows cell –number-dependence.

항-CD47은 CCRF 세포의 식균 작용을 유도합니다. 항-CD47 항체(B6H12.2)의 농도를 증가시켜 처리하고 인간 골수 유래 대식세포(BMDM; 표시된 값은 평균 ± SEM, n=4)에 첨가한 라벨링된 CCRF-CEM 세포.

대식세포 내부에 포획된 세포의 이미징 및 정량화. J774.A1 대식세포 내부에 포식된 주르캇 세포는 세포 식균 작용의 양에 비례하여 높은 형광 강도를 나타냅니다. 2분 간격의 빠른 이미징을 사용하여 개별 포식 이벤트를 보여주는 동영상을 만들 수 있습니다.

분화에 따라 식세포 기능이 결정됩니다. THP-1 세포를 각각 24시간 동안 200 nM PMA, 24시간 동안 200 nM PMA + 20 ng/mL IFNγ + 1 µg/mL LPS 또는 24시간 동안 200 nM PMA + 20 ng/mL IL-4에 노출시켜 M0, M1 또는 M2 마크로파지로 분화시켰습니다. 그런 다음 세포를 pH로도 레드 표지 세포사멸 주르캇과 함께 배양하고 분화된 대식세포의 식세포 능력을 포식한 주르캇의 형광 신호로 평가했습니다. 데이터에 따르면 M0 및 M2 분화 THP-1 세포 모두 M2 대식세포의 항염증 기능과 일치하는 현저히 높은 식세포 능력을 가지고 있는 것으로 나타났습니다.