고객 만족은 저희의 최우선 과제이며, 이 때문에 본 섹션을 설계하여 저희 시약 및 트랜스펙션 실험과 관련해 자주 받는 질문들에 대한 답변을 제공합니다. 이 FAQ는 응용 분야별로 구성되어 있어, 가장 적합한 답변을 쉽게 찾으실 수 있습니다. 저희 팀은 트랜스펙션 데이터베이스(Transfection Database)를 구축하여, 귀하의 세포주에 최적화된 트랜스펙션 조건뿐만 아니라, 저희 제품과 관련된 논문 인용 정보를 확인하실 수 있도록 했습니다. 세포 특이적인 질문이 있거나 특정 조건을 찾으시는 경우, 이 트랜스펙션 데이터베이스를 참고하시거나, 제품 문서 섹션의 프로토콜을 확인하시기 바랍니다.
FectoVIR®-AAV, FectoVIR®-LV, PEIpro® 관련 자주 묻는 질문
혈청 조건, 항생제 사용, 세포 계대/밀도, 그리고 트랜스펙션 효율
jetOPTIMUS® / jetPRIME® / jetPEI®
INTERFERin® / jetPRIME® / in vivo-jetPEI®
jetOPTIMUS® / jetMESSENGER® / in vivo-jetPEI®
in vivo-jetPEI® / in vivo-jetRNA®+ / LipidBrick®
jetMESSENGER® / in vivo-jetRNA®+ / LipidBrick®
LNP 제형화에 관한 자주 묻는 질문(FAQ)
FectoPRO® / FectoCHO® CD Medium
pDNA 서비스와 온라인 플라스미드 설계 플랫폼에 대한 자주 묻는 질문
플라스미드 제조 서비스에 대한 자주 묻는 질문
FectoVIR®-AAV는 AAV 생산 공정에서 원재료로 사용되는 트랜스펙션 시약입니다. 기존의 상용화된 트랜스펙션 시약보다 더 높은 생산성을 제공하며, 전체 생산 비용을 절감할 수 있습니다.
FectoVIR®-AAV의 구조는 기밀이며, Polyplus에서 특허를 출원하였습니다. PEIpro®, FectoVIR®-AAV 및 FectoVIR®-LV는 분자 구조와 제형 모두에서 서로 다릅니다.
만료일은 My Sartorius에서 확인할 수 있는 시험성적서(Certificate of Analysis) 에 표시되어 있습니다.
저희는 FectoVIR®-AAV를 부유 배양 HEK-293 유래 세포(HEK-293T, HEK-293F, Expi293, VPC, VPC2.0 등)에서 성공적으로 사용했습니다. 또한, 고객들께서도 FectoVIR®-AAV가 여러 상용 및 독점 부유 배양 HEK-293 서브클론에서 잘 작동한다고 확인해주셨습니다.
저희는 내부적으로 AAV-2, AAV-5, AAV-8, AAV-9을 생산하고 있습니다. 또한 고객사에서도 다양한 혈청형을 시험한 결과, 유사한 생산성 향상을 확인하였습니다.
FectoVIR®-AAV는 부유(suspension) 및 부착(adherent) 세포 시스템 모두에서 바이러스 역가(viral titer) 측면에서 현저한 개선 효과를 보여줍니다.
렌티바이러스 생산의 경우, 저희는 FectoVIR®-LV 사용을 권장합니다. 이 제품은 현재 접착(Adherent) 세포 배양 시스템과 부유(Suspension) 세포 배양 시스템 모두에서 가장 우수한 성능을 보여주는 전용 트랜스펙션 시약입니다.
FectoVIR®-AAV GMP는 검증된 무균 제조 공정을 보장하는 ICH Q7 GMP Part II 가이드라인에 따라 생산됩니다. 또한, IND 제출을 지원하고 제품의 완전한 추적성을 보장하기 위한 포괄적인 규제 문서가 함께 제공됩니다. 제약 가이드라인에 따라 트랜스펙션 시약을 제조함으로써 위험을 줄이고 환자의 안전을 확보할 수 있습니다.
FectoVIR®-LV는 차세대 트랜스펙션 시약으로, 유전자 변형 세포 치료제(CAR-T, CAR-NK, 유전자 변형 줄기세포 치료 등)에 사용되는 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위해 개발되었습니다. 이 신분자는 약 3년에 걸쳐 개발되었으며, 최종적으로 LVV 역가(titer)를 향상시킬 수 있는 트랜스펙션 솔루션을 제공하게 되었습니다.
만료일은은 “My Sartorius”에서 확인 가능한 분석 인증서(Certificate of Analysis, CoA)에 표시되어 있습니다.
FectoVIR®-LV GMP은 현재 개발 중에 있습니다.
PEIpro®는 대규모 바이러스 생산(주로 AAV와 LV, 그 외 다른 바이러스 포함)을 위해 특별히 개발된 제품으로, 부착 세포(adherent)와 부유 세포(suspension) 모두에서 사용할 수 있으며, 혈청이 포함된 배지와 무혈청 배지 환경 모두에 적합합니다. 또한, PEIpro®는 광범위한 품질 관리(QC)를 거쳐 치료용 바이러스 생산에 적합하도록 제공됩니다.
PEIpro®, PEIpro®-HQ 및 PEIpro®-GMP는 분자량이 기밀 정보인 선형 폴리에틸렌이민(PEI)으로 구성되어 있습니다. 최적의 DNA 전달과 가장 낮은 세포 독성을 in vitro에서 구현하기 위해 광범위한 최적화 실험이 수행되었습니다.
PEIpro®는 선형 PEI의 수용액 형태로 제공됩니다.
PEIpro®는 의도치 않게 한 번 정도의 동결/해동 과정을 거쳐도 형질감효율(transfection efficiency)이 손상되지 않습니다. 그러나 장기 보관을 위해서는 시약의 장기 안정성을 보장하기 위해 5°C ± 3°C에서 보관할 것을 권장합니다.
만료일은 "My Sartorius"에서 확인할 수 있는 분석 인증서(Certificate of Analysis)에 표시되어 있습니다.
바이러스 벡터의 유형에 따라 서로 다른 HEK-293 세포 아형이 선호됩니다. 예를 들어, 아데노바이러스와 AAV 바이러스 생산에는 HEK-293 세포가, AAV 및 렌티바이러스 생산에는 HEK-293T 및 HEK-293FT 세포가 주로 사용됩니다. PEIpro®는 부착(Adherent) 및 부유(Suspension) 상태의 HEK-293 세포 아형 모두에서 바이러스 생산에 적합합니다.
다양한 배양 용기들이 사용될 수 있습니다. 예를 들어, HYPERFlasks™ 및 HYPERstacks™(Corning)와 같은 다층 플라스크, iCELLis® 바이오리액터(Pall)와 같은 고정층 배양 시스템은 부착형 HEK-293 세포에서 PEIpro® 사용과 호환됩니다. 또한 부유형 HEK-293 세포에서 바이러스 생산을 위해서는 대형 셰이커 플라스크나 바이오리액터를 사용할 수 있습니다.
많은 다른 형질도입(트랜스팩션) 시약들과는 달리, 저희 제품은 모두 혈청과 호환되므로 혈청이 포함된 배지에서도 복합체를 세포에 직접 첨가할 수 있습니다.
저희 제품은 어떤 것도 항생제 존재 여부에 의해 형질도입(트랜스팩션) 효율이 영향을 받지 않습니다. 예를 들어, 새로운 배치의 jetPRIME®에 대한 정규 검증 프로토콜은 항상 혈청과 항생제가 포함된 배지에서 수행됩니다.
많은 세포 배양 배지가 포유동물 세포의 성장과 유지를 위해 사용되며, 그중 일부는 양이온성 중합체/지질 매개 형질도입을 억제할 수 있습니다. 형질도입과의 배지 호환성에 대한 더 많은 정보를 원하시면, 당사의 전달 전문가에게 문의하시기 바랍니다.
계대수는 트랜스펙션 성능에 영향을 줍니다. 세포가 장기간(20회 이상 계대) 배양된 경우 트랜스펙션 효율이 감소하므로, 액체 질소에서 꺼낸 새로운 세포 튜브로부터 새로운 배양을 시작하는 것을 권장합니다. 반대로, 세포를 해동한 직후에는 최소 두 번 이상 계대 배양을 진행한 뒤 트랜스펙션 실험을 시작해야 합니다.
세포 밀도는 트랜스펙션 성능에 영향을 줍니다. 트랜스펙션 시점에서 권장되는 세포 밀도(컨플루언스)는 사용하는 트랜스펙션 시약에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서, 원하는 컨플루언스를 얻기 위해서는 해당 시약 프로토콜을 참조하여 트랜스펙션 당일에 적절한 세포 밀도를 달성할 수 있도록 권장 세포 접종 수를 확인하는 것이 필요합니다.
비율은 트랜스펙션 시약 1마이크로리터(µl) 당 사용할 핵산의 양(마이크로그램, µg)에 해당합니다. 예를 들어, 1:2 비율은 핵산 1µg 당 트랜스펙션 시약 2µl를 의미합니다.
트랜스펙션 효율을 향상시키기 위해 변경할 수 있는 여러 가지 매개변수가 있습니다. 최적화를 원하신다면, 당사의 과학 지원팀([support@polyplus-transfection.com](mailto:support@polyplus-transfection.com))으로 문의하시기 바랍니다.
jetOPTIMUS®는 부착 세포의 일상적인 트랜스펙션, 심지어 트랜스펙션이 어려운 세포에도 권장되는 시약입니다. 여러 플라스미드의 공동 전달 및 소규모 바이러스 생산에도 적합합니다. jetOPTIMUS®를 사용한 트랜스펙션은 세포 생존율과 형태에 최소한의 영향을 주면서 더 높은 트랜스펙션 효율과 유전자 발현을 유도합니다.
jetPRIME®는 다양한 부착 세포주에서 DNA 및 siRNA 트랜스펙션을 효과적이고 재현성 있게 보장하는 다목적 트랜스펙션 시약입니다. 이 다재다능한 시약은 DNA와 siRNA의 공동 트랜스펙션에도 적합합니다. jetPRIME®를 사용한 트랜스펙션은 적은 양의 핵산만 필요하므로 세포 독성이 매우 낮습니다.
jetPEI® 트랜스펙션 시약은 자동화 또는 수동 고처리량 스크리닝(HTS: High Throughput Screening)에 특히 적합하며, 역방향, 배치, 순방향의 세 가지 프로토콜을 제공합니다.
jetPEI®는 매우 재현성 있는 결과를 제공하며, DNA/jetPEI® 복합체는 최대 4시간 동안 안정성을 유지합니다.
여러 개의 플라스미드를 공동 트랜스펙션할 경우, 웰당 총 DNA 양이 jetOPTIMUS® 프로토콜에 명시된 최대 DNA 양을 초과하지 않도록 권장합니다. 각 플라스미드에 사용할 비율은 플라스미드의 크기, 플라스미드 구조, 그리고 각 플라스미드의 예상 발현 수준에 따라 달라집니다. 각 플라스미드는 웰당 총 DNA 양의 최소 10% 이상을 차지해야 합니다.
플라스미드 DNA/siRNA 공동 트랜스펙션의 경우, 저희는 jetPRIME® 시약을 권장합니다. DNA와 siRNA 공동 트랜스펙션에 대한 표준 프로토콜을 참고하시기 바랍니다.
DNA/ssODN(단일가닥 올리고데옥시뉴클레오티드) 공동 트랜스펙션의 경우에도 동일한 프로토콜을 적용할 수 있습니다.
jetOPTIMUS®는 원발세포(상피세포, 간세포, 내피세포, 섬유아세포 등), 줄기세포(배아줄기세포, 중간엽줄기세포, 유도만능줄기세포) 및 암 세포주와 같은 트랜스펙션이 어려운 세포의 DNA 트랜스펙션에 적합합니다.
그러나 림프구 세포주, 섬유아세포, 뉴런과 같은 일부 부유성 세포 및 원발세포는 DNA로 트랜스펙션하기가 매우 어렵습니다. Polyplus®는 이러한 세포를 위해 mRNA 전달을 목적으로 설계된 지질 기반 트랜스펙션 시약인 jetMESSENGER®를 개발했습니다. 이 시약은 림프종 및 혈액 세포주, 뉴런 및 다양한 원발세포 등 트랜스펙션이 어려운 세포에서 높은 효율을 보였습니다. DNA와 비교했을 때, mRNA 트랜스펙션은 더 높은 비율의 세포가 트랜스펙션되며, 트랜스펙션 후 더 빠른 단백질 발현을 유도하고, 플라스미드나 바이러스 벡터와 달리 게놈 삽입의 위험이 없습니다.
최적의 트랜스펙션 효율을 위해 jetOPTIMUS® 또는 jetPRIME®을 사용할 때에는 복합화 시간을 10분을 넘기지 않는 것을 권장합니다. 따라서 하이 스루풋 스크리닝(High Throughput Screening)과 같이 더 긴 배양 시간이 필요한 경우, jetPEI® 사용을 권장합니다. jetPEI®/DNA 및 DNA/jetOPTIMUS® 복합체는 최대 4시간까지 안정적입니다.
해당 시약들을 사용할 때 DNA 트랜스펙션에는 크기 제한이 없습니다. 그러나 동일한 양의 DNA를 사용할 경우, 큰 DNA 컨스트럭트에서는 작은 플라스미드에 비해 유전자 복제 수가 더 적다는 점은 유의해야 합니다.
jetOPTIMUS®는 DNA와 결합하여 양전하를 띠는 복합체를 형성하며, 이 복합체는 세포 내로 엔도사이토시스를 통해 유입됩니다. 엔도솜 내부에서는 프로톤 스펀지 메커니즘(proton sponge mechanism, Behr, Chimia 1997)에 의해 DNA가 세포질로 방출됩니다. 플라스미드는 주로 유사분열(mitosis) 시기에 핵막이 일시적으로 소실될 때 핵으로 진입합니다. 이러한 이유로, 일차 세포(primary cells) 또는 세포 분열 속도가 느린 세포주(cell lines)는 일반적으로 트랜스펙션이 어려운 특성을 보입니다.
INTERFERin®은 siRNA 트랜스펙션을 위한 최적의 시약으로, 최소 1 nM의 siRNA만으로도 작동합니다.
jetPRIME®은 더 높은 농도(10–50 nM)의 siRNA 전달에 적합하며, 특히 DNA/siRNA를 동시에 전달(co-delivery)해야 하는 경우 권장됩니다.
또한, siRNA 또는 miRNA를 **생체 내(in vivo)** 에서 전달하고자 한다면, 이 응용 분야에 가장 적합한 시약은 in vivo-jetPEI®입니다.
shRNA는 플라스미드 벡터나 올리고뉴클레오타이드 형태로 트랜스펙션할 수 있습니다. shRNA를 올리고뉴클레오타이드 형태로 트랜스펙션하는 경우에는 INTERFERin® 시약을 사용하는 것이 권장됩니다. shRNA 발현 벡터를 사용하는 경우에는 jetOPTIMUS® 또는 jetPRIME® 시약이 더 적합합니다. 체내 환경에서 shRNA 전달을 목적으로 할 경우에는 in vivo-jetPEI®를 사용하는 것이 추천됩니다.
in vivo–jetPEI®는 강력한 고분자 기반 시약으로, 어떤 동물 모델에도 올리고뉴클레오타이드를 전달하는 데 적합합니다. 이 프로토콜은 고전적인 트랜스펙션과 유사하며, 핵산과 시약을 단순히 혼합하여 동물에 투여하면 됩니다.
저희는 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(ssODN) 전달을 위해 jetPRIME® 시약을 사용하는 것을 권장합니다.
플라스미드 DNA와 ssODN을 동시에 트랜스펙션해야 하는 경우(예: CRISPR/Cas9 응용), DNA와 siRNA 동시 트랜스펙션을 위한 표준 프로토콜을 참고하시기 바랍니다.
miRNA라고 불리는 여러 유형의 분자가 있습니다. miRNA라는 용어는 다음을 의미할 수 있습니다:
mimic miRNA: 이들은 구조적으로 siRNA와 유사하지만 동일하지 않으며, INTERFERin®으로 트랜스펙션할 수 있습니다. plasmid encoding for miRNA: 이 분자는 jetOPTIMUS®을 사용하여 트랜스펙션할 수 있습니다.antimiR: 이는 내인성 microRNA에 특이적으로 결합하고 억제하도록 설계된 단일 가닥 핵산으로, INTERFERin®으로 트랜스펙션할 수 있습니다.
트랜스펙션된 올리고뉴클레오타이드의 동일한 양이라도, 올리고뉴클레오타이드의 크기에 따라 전달되는 복제본의 수가 달라집니다. (더 긴 올리고뉴클레오타이드일수록 복제본 수는 적고, 더 짧은 올리고뉴클레오타이드일수록 복제본 수는 많아집니다). 따라서, 올리고뉴클레오타이드의 양은 이에 맞게 조정해야 합니다.
jetMESSENGER®는 in vitro mRNA 형질도입에 가장 적합한 시약입니다. jetMESSENGER® 프로토콜은 간단하며, 준비된 상태로 제공되고 다양한 부착 및 부유 세포 유형의 표준 배양 배지(혈청 및 항생제 포함 여부와 관계없이)와 호환됩니다. jetMESSENGER®는 매우 부드러운 과정을 통해 작동하며, 쥐의 대뇌 피질 뉴런, 인간 간암 세포, 생쥐 배아 줄기세포 등 형질도입이 어려운 다양한 세포에서도 세포 생존율과 형태를 유지합니다.
in vivo mRNA 전달에는 in vivo-jetRNA®+가 최적의 시약입니다. in vivo-jetRNA®+는 in vivo에서 mRNA 전달을 위해 특별히 개발된 전형적 리포솜으로 구성된 준비된 형질도입 시약입니다. 이 시약은 마우스, 랫트 등 다양한 동물 모델에서 전신 주입 경로를 사용하여 하나 이상의 장기를 표적화할 수 있습니다. in vivo-jetRNA®+는 사용하기 간단한 2단계 프로토콜로, 지질 나노입자(LNPs)와 유사한 수준의 효율적인 전달 결과를 제공합니다. 이 시약은 백신/면역 목적, 항암 연구, CRISPR/Cas9을 이용한 유전자 편집, 단백질 보충에 활용될 수 있습니다.
또한 LipidBrick® 계열을 통해 LNP 제형화에 사용되는 양이온성 지질도 제공합니다. 이러한 활성 지질은 mRNA 분자를 보호하고 LNP의 형질도입 능력에서 중요한 역할을 합니다. 특히, 이미다졸륨 기반의 극성 머리를 바탕으로 하는 LipidBrick®은 기존의 이온성 지질 기반 LNP에 비해 폐와 비장으로의 mRNA 전달을 강화하고 간에서의 축적을 줄여 LNP 적용 범위(효능 및 조직 분포)를 넓혀줍니다.
마지막으로 LipidBrick® IM21.7c는 jetMESSENGER®와 in vivo-jetRNA®+의 제형화에 사용되는 활성 지질(양이온성 지질)로, 준비된 시약과 맞춤형 LNP 제형 사이에서 원활한 전환을 가능하게 해 다양한 연구 및 응용 목적에 대응할 수 있습니다.
mRNA는 DNA 주형으로부터 체내 전사(IVT)를 통해 제작할 수 있으며, 시판되는 솔루션(예: New England Biolabs의 HiScribe™ kit)을 이용하거나, Trilink, Eurofins, Aldevron 등 다양한 올리고뉴클레오타이드 공급업체를 통해 “맞춤 제작(custom made)” 형태로 구매할 수도 있습니다.
Polyplus의 D-zyvec 플랫폼을 활용하면 사용자의 요구에 맞춰 특별히 설계되고 선형화된 DNA 주형을 제작할 수 있습니다. 더 자세한 사항은 당사 과학 지원팀(Scientific Support team)에 문의하실 수 있습니다.
참고로, DNA 주형은 반드시 선형화되어야 하며, 전사될 서열의 상류(5’ 말단, sense RNA의 경우) 또는 하류(3’ 말단, antisense RNA의 경우)에 RNA 중합효소 프로모터 영역(T7 또는 SP6 등)을 포함해야 합니다. 필요한 경우, PCR 프라이머에 최소한의 프로모터 서열을 포함시켜 전사될 서열 앞쪽에 프로모터 영역을 추가할 수도 있습니다.
일반적으로 말해, 시험관 내 전사 후 mRNA 정제는 필수적이지 않습니다. RNA 오염물이 최소한으로 존재하기 때문입니다. 하지만 필요하다면, 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 예를 들어 페놀-클로로포름 추출/에탄올 침전법, LiCl 침전법, 겔 정제 방법 및 시중에서 판매되는 다양한 mRNA 분리 키트가 적합합니다.
mRNA 크기에는 본질적인 제한이 없습니다. 다만, 시중의 mRNA 합성 키트는 보통 0.3~5 kb 범위의 mRNA 전사체에 맞춰 최적화되어 있으며, 이는 약 10~150 kDa 크기의 단백질에 해당합니다. 따라서 이 범위를 벗어난 짧거나 긴 mRNA 전사체를 합성하려면 동일한 수준의 높은 수율을 얻기 위해 추가적인 최적화가 필요할 수 있습니다.
DNA 트랜스펙션과 비교했을 때, jetMESSENGER® 및 in vivo–jetRNA®+를 이용한 mRNA 매개 트랜스펙션은 프로모터에 의존하지 않는 보다 조절된 유전자 발현을 유사한 기간 동안 가능하게 합니다. 활발히 분열하는 세포에서는 mRNA 발현이 트랜스펙션 후 1\~4일 사이에 더 뚜렷하고 안정적으로 관찰됩니다. 분열이 느리거나 거의 분열하지 않는 세포에서는 mRNA 발현이 더 긴 기간 동안 안정적으로 유지될 수 있으며, 예를 들어 1차 신경 세포에서는 최대 7일까지 지속될 수 있습니다.
내재적 진핵생물 mRNA의 합성 과정에서, 새로 생성되는 전사체의 5’ 말단에는 7-메틸구아노신 캡(CAP)이 추가되어 분해로부터 보호하고 번역률을 높입니다. 또한 새로 합성된 mRNA의 3’ 말단에 존재하는 polyA-tail은 분해로부터 추가적인 보호를 제공하며, 성숙한 mRNA의 핵 내 수출에도 중요한 역할을 합니다. 따라서 기존의 mRNA 합성 키트는 일반적으로 5’ 캡 유사체(cap analog)와 3’ polyA-tail의 도입을 통해 mRNA의 안정성을 높이는 옵션을 제공합니다.추가적으로, mRNA 서열 내 특정 염기 변형(예: 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌)을 도입하여 안정성을 높이고 면역원성을 줄일 수 있습니다. 맞춤 제작된 mRNA를 주문할 때는 Pseudo-Uridine 같은 특수 변형을 포함시켜 안정성을 더욱 향상시킬 수 있습니다.
그러나 RNA 전사체의 안정성을 높이는 것이 항상 필요한 것은 아닙니다. 예를 들어, 일부 바이러스 RNA 전사체는 트랜스펙션 이후 복제를 시작하거나 감염성 바이러스를 생성하는 데 있어 캡핑이나 polyadenylation이 필요하지 않습니다.
mRNA 전달은 일시적인 발현에는 적합하지만, 안정적인 클론을 생성하는 데에는 적합하지 않습니다. mRNA는 세포 유전체에 통합될 수 없기 때문에 안정적인 클론을 만들 수는 없지만, 그 대신 숙주 세포의 유전체를 변형하지 않는다는 장점이 있습니다.
CRISPR 매개 유전자 편집은 트랜스펙션을 통해 가이드 RNA와 Cas9 단백질을 표적 세포에 도입하는 것을 필요로 합니다. 검증된 방법은 가이드 RNA와 Cas9 단백질을 플라스미드 DNA 형태로 전달하는 것이며, 이를 위해 당사의 최신 기술인 jetOPTIMUS®를 추천합니다. jetOPTIMUS®는 가장 다양한 1차 세포 및 세포주에서 최고의 유전자 편집 효율을 보장합니다.
전통적인 플라스미드 기반 방법에서 발생할 수 있는 오프타겟 효과가 우려될 경우 DNA 프리 유전자 편집 방법이 고려됩니다. gRNA와 Cas9 단백질을 mRNA 형태로 전달하는 방식은 부착성 및 부유성 세포 모두에서 강력한 유전자 편집 효율을 달성할 수 있는 가장 널리 사용되는 DNA 프리 대안입니다.
전체 RNA 접근법(즉, Cas9을 암호화하는 mRNA와 가이드 RNA)을 사용할 경우, 당사의 jetMESSENGER® 트랜스펙션 시약을 권장합니다.
마지막으로 혼합 접근법(즉, Cas9을 암호화하는 플라스미드 DNA와 RNA 형태의 gRNA)을 사용할 경우, 가장 적합한 시약은 jetPRIME®입니다.
체내 CRISPR 매개 유전자 편집을 위해 우리가 선택하는 시약은 in vivo-jetPEI®입니다. 여러 연구 그룹이 in vivo-jetPEI®를 사용하여 마우스에서 유전자 편집을 수행한 결과를 발표했습니다:
Zuckermann, M. & al. (2015). Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun 6, 7391
He, S. & al. (2016) Annexin A2 Modulates ROS and Impacts Inflammatory Response via IL-17 Signaling in Polymicrobial Sepsis Mice. PLoS Pathog 12, e1005743
Takao T. et al. (2020) Optogenetic regulation of embryo implantation in mice using photoactivatable CRISPR-Cas9. Proc Natl Acad Sci U S A 117 28579-28581
Pallarès-Masmitjà M. et al. (2021) Find and cut-and-transfer (FiCAT) mammalian genome engineering. Nat Commun 12 7071
McFadden T. et al. (2022) Short-term exposure to an obesogenic diet causes dynamic dysregulation of proteasome-mediated protein degradation in the hypothalamus of female rats. Nutr Neurosci 1-13
in vivo-jetPEI®는 DNA, siRNA, 모방 miRNA 및 기타 올리고뉴클레오타이드와 같은 모든 유형의 핵산을 체내에서 전달할 수 있도록 설계된, 사용 준비가 완료된 고분자 기반 트랜스펙션 시약입니다.
in vivo-jetRNA®+는 체내에서 mRNA를 전달하도록 특별히 개발된, 사용 준비가 완료된 지질 기반 트랜스펙션 시약입니다.
LipidBrick®은 지질 나노입자(LNP) 제형을 위해 고안된 양이온성 지질 계열입니다. 이러한 활성 지질은 mRNA 분자를 보호하고, LNP의 트랜스펙션 효율에서 중요한 역할을 합니다.
in vivo-jetPEI®는 생쥐에서 핵산 전달에 이상적입니다.그러나 프로토콜이 매우 간단하고 범용적이어서 쥐, 모기, 새우, 기니피그, 마카크원숭이 등 다양한 다른 종에도 적용되었습니다.
in vivo-jetRNA®+ 역시 매우 간단한 2단계 프로토콜을 가진 즉시 사용 가능한 시약입니다. 비교적 최근(2022년 말) 출시된 시약으로, 현재까지는 생쥐와 쥐에서 사용되었습니다.
귀하의 동물 모델에 맞게 프로토콜을 조정하려면 저희 과학 지원팀에 문의해 주시기 바랍니다: polyplus-Support@Sartorius.com
in vivo–jetRNA®+와 in vivo–jetPEI®는 전신 및 국소 핵산 전달에 모두 적합합니다. 정맥 주사(꼬리 정맥 및 안와 뒤), 복강 내 주사, 종양 내 주사, 뇌 내 주사, 비강 내 점적 등 여러 투여 방식이 성공적으로 시험되었습니다.
전달 절차는 표적화하려는 장기에 크게 의존합니다. 투여 경로에 따라 in vivo-jetRNA®+ 또는 in vivo-jetPEI® 매개 유전자 발현은 뇌, 간, 췌장, 비장, 신장, 심장, 방광, 피부, 망막 등에서 관찰됩니다.
특히, 이미다졸륨 극성 머리에 기반한 LipidBrick®은 LNP(지질 나노입자)에 전체적인 양전하를 부여하여 효능과 분포 범위를 확장합니다. 이로 인해 기존의 이온화성 지질 기반 LNP에 비해 간 내 축적은 줄이고 폐와 비장에서 mRNA 전달이 더 효과적으로 이루어집니다.
더 많은 조언이 필요하다면 당사의 과학 지원팀에 문의하시기 바랍니다. polyplus-Support@Sartorius.com
핵산과 in vivo-jetPEI® 사이에서 형성된 복합체는 시간이 지나도 응집되지 않으며, 실온이나 37 °C에서 최소 4시간, 4 °C에서는 최대 7일 동안 안정적입니다.
반면, mRNA/in vivo-jetRNA®+ 복합체는 실온에서 최대 72시간, 4 °C에서는 최대 1개월 동안 안정적입니다.
따라서 이러한 복합체는 사전에 준비할 수 있으며, 이는 삼투 펌프를 사용한 지속적 전달에도 적합합니다.
우리는 임상 시험용으로 인간에게 사용할 수 있는 GMP 등급 in vivo-jetPEI®를 제공합니다. 이 제품은 미국과 유럽의 최신 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준(cGMP)을 모두 준수하여 제조되며, 임상 1상부터 3상까지 사용이 적합합니다. 현재 전 세계적으로 점점 더 많은 치료제에서 사용되고 있습니다.
반면에, in vivo-jetRNA®+는 아직 GMP 등급으로 제공되지 않지만, 고객 요청에 따라 GMP 등급으로 개발할 가능성이 있습니다. 다만, 이 경우 개발에는 약 12~18개월이 소요되며, 최소 주문 수량 요건이 있습니다.
FectoPRO®는 부유 배양에서 단백질 생성을 위한 최적의 시약으로, 포유류 일과성 유전자 발현(TGE, Transient Gene Expression) 시스템을 사용하는 연구자들이 최고의 결과를 얻을 수 있도록 개발되었습니다. FectoPRO®는 다양한 배지에서 자란 CHO 및 HEK-293 세포주에서 가장 높은 트랜스펙션 효율과 단백질 수율을 보장합니다. 또한 세포 생존율이 높고, 재현성이 우수하며, 결과의 일관성이 뛰어납니다. 시중에 판매되는 다른 시약보다 성능이 우수하며, DNA와 시약이 적게 필요하므로 어떤 규모에서도 포유류 단백질 생산 공정을 최적화할 수 있습니다.
대규모 또는 초대규모 실험의 경우, HEK-293 세포에서 효율이 높고 비용 효율적인 PEIpro®를 고려할 수 있습니다.
부착 배양 시스템에서 단백질을 생산하는 경우, PEIpro® 또는 jetOPTIMUS®를 사용할 수 있습니다.
FectoPRO®는 FectoPRO® 부스터 없이도 사용할 수 있습니다. 하지만 적은 DNA 양으로 **높은 단백질 생산량**을 달성하려면 FectoPRO® 부스터를 사용하는 것이 권장됩니다.
FectoPRO®는 일반 세포 밀도 시스템뿐만 아니라 고세포 밀도 시스템에서도 매우 잘 작동합니다. 이 제품은 짧은 시간 안에 더 높은 단백질 수율을 얻을 수 있게 해주며, 재조합 단백질 생산을 위해 7일 또는 12일 동안 세포 성장을 기다릴 필요가 없습니다.
최적의 DNA 사용량은 FectoCHO® 발현 시스템 프로토콜에 따르면 세포 배양액 1mL당 0.8 µg DNA입니다. 만약 다른 배지를 사용하여 FectoPRO®를 적용한다면, FectoPRO® 전용 프로토콜을 참고해야 합니다. 다만, FectoCHO™ CD 발현 배지와 FectoPRO® 고효율 트랜스펙션 시약을 함께 사용하면 시너지 효과가 발생하여 단백질 생산 수율이 더 높아질 수 있다는 점을 유의해야 합니다.
FectoPRO®와 PEIpro® 모두 부유 상태(suspension)와 무혈청 배지에서 HEK293 세포와 잘 작동하는 것으로 입증되었습니다. 그러나 어떤 용도인지에 따라 달라집니다. FectoPRO®는 단백질 생산에 사용되고, PEIpro®는 바이러스 생산에 사용됩니다.
아니요, 먼저 배지를 구입하고 그다음에 형질감염 시약을 따로 구입할 필요는 없습니다. FectoCHO™ 발현 시스템 키트는 세포를 FectoCHO™ CD 발현 배지에 적응시키고, FectoPRO® 형질감염 시약을 사용하여 형질감염을 수행하는 데 완벽히 적합합니다. 실제로 FectoCHO™ 발현 시스템 키트(ref# 101000011)에는 1L의 배지와 1mL의 형질감염 시약이 포함되어 있으며, 두 시약이 완벽한 비율로 제공되어 세포 적응부터 단백질 생산까지 전체 실험을 수행할 수 있습니다. 가격 문의가 필요하다면 언제든지 저희에게 연락 주시기 바랍니다.
사용된 배지에 따라 1mL의 FectoPRO®는 500mL에서 1L의 세포 배양을 형질감염하기에 충분합니다.
mL당 DNA 양은 ExpiCHO™ 세포에서 FectoCHO® 발현 시스템이나 ExpiCHO™ 발현 시스템을 사용하든 동일합니다. 그러나 FectoCHO®를 사용하면 더 낮은 비용으로 최대 두 배의 단백질 생산 수율을 얻을 수 있다는 점을 유념해야 합니다.
FectoCHO® CD 배지는 ExpiCHO® 세포의 배양 및 일시적 단백질 발현에 사용할 수 있습니다. 그러나 이것은 즉시 사용할 수 있는 플러그 앤 플레이 시스템이 아니며, 사전에 적응 및 최적화 단계가 필요하다는 점을 유념해야 합니다.
지질 나노입자(LNP)는 현재 임상적으로 승인된 유일한 비바이러스성 RNA 전달체입니다. 최근 코로나바이러스 유행 이후 mRNA 백신의 성공을 통해 그 안전성이 입증되었습니다. COVID-19 백신은 제형화의 용이성, 보호 특성, 그리고 큰 적재 용량 덕분에 LNP를 신속히 채택했습니다. 현재 LNP는 백신을 넘어 인간에서의 mRNA 치료제 응용 개발을 가속화하고 있습니다.
mRNA-LNP의 생체 내 분포와 안정성을 개선하고 독성을 줄이기 위해서는 여전히 추가적인 개발이 필요합니다. LNP 제형 내에서 사용되는 이온화 가능한 양이온 지질은 어떤 기관이 형질감염되는지, mRNA 전달 효율, 그리고 분해 가능성에 직접적인 영향을 줍니다.
저희는 “디스커버리 등급*” 플라스미드를 나사 캡 플라스틱 튜브에 담아, 원형의 이중 가닥 DNA 분자로 제공하며, 1X AE 버퍼(miniprep.) 또는 1X TE 버퍼(midi, maxi, giga prep.)에 재부현탁된 상태로 실온에서 전달합니다. 참고로 저희는 박테리아 주(bacterial stock)는 제공하지 않습니다.
디스커버리 등급 플라스미드는 여러 포맷으로 주문이 가능하며, 자세한 내용은 문의해 주시기 바랍니다.
더 큰 규모나 더 높은 품질 등급의 플라스미드 생산이 필요하다면 Plasmid Manufacturing Service를 문의해 주세요.
*디스커버리 등급이란 플라스미드가 무균 환경에서 좋은 실험실 관행(GLP)에 따라 생산되지만, 품질 관리가 기본적인 품질 및 동일성 테스트로 제한된다는 의미입니다. 따라서 디스커버리 등급 플라스미드는 연구용 애플리케이션에만 사용되어야 합니다.
QC는 기본적인 품질 및 정체성 검증으로 제한됩니다:
QC 결과는 제품 전달 양식(Product Delivery Form)에 문서화됩니다.
참고: discovery grade 플라스미드의 경우 엔도톡신 수준은 측정되지 않습니다.
대부분의 프로젝트에서는 기존 플라스미드나 다른 DNA 물질을 보내실 필요가 없습니다. 원하는 서열은 DNA 합성(외부 위탁)을 통해 생성할 수 있습니다.
그러나 일부 프로젝트에서는 기술적 복잡성을 극복하거나, 기술적 연속성을 보장하거나, 단순히 비용을 줄이기 위해 귀하께서 DNA 물질(플라스미드 템플릿 또는 정제된 gDNA만)을 보내주셔야 할 수도 있습니다.
이 경우, 다음 지침을 따라 주십시오:
튜브 발송 주소: Sartorius Polyplus Production Team 80 rue du Dr Yersin 59120 Loos FRANCE
주의: 프로젝트 시작 전 모든 플라스미드 템플릿은 NGS로 완전히 시퀀싱됩니다.
gDNA 샘플의 경우, 샘플의 무결성을 평가하기 위해 아가로스 겔 사진을 함께 보내주십시오.
우리는 DNA 합성을 사내에서 수행하지 않으며, 이는 외부에 위탁합니다.
우리는 최대 30Kb 크기의 플라스미드를 조립하는 데 성공한 경험이 있습니다. 더 큰 크기의 플라스미드는 일반적인 유능한 E. coli 균주에서 증폭하기 어렵다고 간주될 수 있습니다. 그러나 프로젝트에 그러한 대형 플라스미드가 필요하다면 언제든 문의해 주시기 바랍니다. 특정한 솔루션이 적용될 수 있습니다.
저희는 두 가지 수준의 서비스를 운영합니다: STANDARD와 PREMIUM
* 구매 주문 확인서를 수령한 후 기준
수령 후, 엔지니어드 플라스미드가 담긴 튜브를 잠깐 원심분리기(벤치형 원심분리기)로 스핀 다운한 뒤 다음과 같이 보관하십시오:
우리는 장기 보관 시 Polyplus 발견 등급 플라스미드를 분주하여 보관하고, 동결-해동 사이클을 피할 것을 강력히 권장합니다.
여기서 제시된 보관 기간은 참고용입니다. 장기 보관한 플라스미드의 무결성은 젤 전기영동(변성 여부) 또는 시퀀싱(염기서열 무결성)을 통해 반드시 확인해야 합니다.
엔지니어드 발견 등급 플라스미드는 연구용 응용을 위해 직접 증폭할 수 있습니다.
저희의 박테리아 복제 기원은 고전적인 pBR322/pUc 플라스미드와 동일한 방식으로 작동합니다. 따라서 공급업체 가이드라인에 따라 어떤 E. coli 균주도 사용할 수 있습니다. 또한 제품 전달 양식에 플라스미드 증폭 시 사용한 배양 온도와 항생제 선택 정보를 명시합니다. 참고로, 저희가 일반적으로 사용하는 항생제 농도는 암피실린 100µg/mL, 카나마이신 30µg/mL입니다.
저희는 자체 제작한 엔지니어드 플라스미드뿐만 아니라 고객이 보내주신 플라스미드에 대해서도 pDNA 증폭 서비스를 제공합니다.
증폭은 소규모(수 mg 수준)에서 Discovery grade로 진행할 수 있으며, 대규모(수 g 수준) 증폭은 R&D, High Quality, 또는 GMP grade로 Plasmid Manufacturing Service를 통해 수행할 수 있습니다.
별도로 프로젝트 명세에 명시되지 않은 한, 연구 목적으로 서비스 기반 계약에 따라 제공되는 모든 엔지니어드 플라스미드는 Polyplus의 지적재산권(IP)으로부터 자유롭습니다. T&C. Polyplus 또는 제3자 기관과의 라이선스 계약이 필요한 경우도 있습니다.
Polyplus 플라스미드 시퀀싱 서비스는 전체 플라스미드 서열 분석을 전용으로 제공합니다. 따라서 출발 물질은 정제된 이중가닥 DNA 플라스미드여야 합니다.
또한, 어떠한 생물체의 전체 게놈 시퀀싱은 수행하지 않는다는 점에 유의하시기 바랍니다.
아래 지침에 따라 샘플을 보내실 수 있습니다:
샘플은 아래 주소로 보내주셔야 합니다:
Polyplus-Transfection Production Team 80 rue du Dr Yersin 59120 Loos FRANCE
가능하다면, 당사 플랫폼에 샘플의 기준 서열(reference sequences)을 입력해 주시기 바랍니다.
우리는 두 가지 수준의 서비스를 제공합니다: Standard와 Express.
시퀀싱 후에는 다음과 같은 데이터를 제공합니다:
시퀀싱 보고서와 플라스미드의 전체 서열은 귀하의 계정에서 확인할 수 있습니다.
저희는 de novo 분석을 수행합니다.
저희는 단일 샘플에 대해서도 NGS를 수행합니다. 샘플 수에는 별도의 제한이 없으며, 동시에 최대 150개 샘플까지 시퀀싱 할 수 있습니다.
현재 저희는 Illumina 기술(짧은 읽기, 150 bp)을 사용하여 NGS를 수행합니다.
저희는 컨설팅 서비스를 제공합니다. 만약 시퀀싱 결과에 대한 특정 생물정보학적 분석이 필요하시다면, 저희에게 문의해 주세요.
온라인 pDNA 서비스 플랫폼은 Mozilla Firefox, Google Chrome, Microsoft Edge에서 테스트되었습니다. Opera나 Safari 같은 다른 브라우저에서도 동작은 하지만, 모든 기능에 대한 완전한 호환성은 보장되지 않습니다.
저희는 현재 진행 중인 프로젝트를 볼 수는 있지만**, 별도의 요청이 없는 한 수정하거나 제안하지는 않습니다.
프로젝트 생성과 제출 사이에는 시간 제한이 없습니다. 예를 들어, 프로젝트를 저장해 두었다가 몇 달 후에 다시 돌아와서 작업을 이어갈 수도 있습니다.
프로젝트를 제출하면, 플라스미드 전문가가 필요한 플라스미드의 수, 복잡성, 필요한 합성 횟수, 요청된 증폭 규모를 기준으로 견적서를 제안해 드립니다.
요청사항은 저희의 문의 양식을 통해 제출해 주십시오. 첫 번째 개략적인 견적은 신속하게 보내드립니다. 요청된 플라스미드의 수량과 품질 등급에 따라, 적합한 전략, 단계별 작업 패키지와 산출물, 일정 및 관련 예산이 포함된 상세 견적이 제공됩니다.
R&D 등급 배치 1개를 제조하는 데 소요되는 시간은 세포은행의 존재 여부에 따라 4~~6주 사이입니다. 플라스미드 4개 세트 제조에는 9~~11주가 필요합니다. 또한, GMP 등급 배치 1개를 출시하려면 추가로 10주가 더 필요합니다.
전달 가능한 플라스미드의 최대 수량은 품질 등급(R&D, HQ, GMP)에 관계없이 20 g입니다.또한, 디스커버리 등급(discovery grade)에서는 최대 50 mg까지 pDNA 증폭 서비스를 제공합니다.
플라스미드 생산 프로젝트는 Xpress Biologics에서 생성한 세포은행(cell bank)이나 고객이 제공한 세포은행을 이용하여 수행될 수 있습니다. 생물안전 목적상, 고객이 제공하는 세포은행은 박테리오파지(bacteriophage)의 부재를 입증하는 CoA(Certificate of Analysis)와 함께 제공되어야 합니다.
HQ 등급 플라스미드는 전임상 시험을 위한 원료의약품(drug substance)으로 사용되거나, 전임상 및 임상 1/2상 시험을 위한 출발 물질로 사용될 수 있습니다. 생산 및 정제된 플라스미드는 물리적 상태, 동일성, 함량, 순도/불순물, 안전성과 관련된 특성을 포함하는 완전한 품질 관리 세트를 통해 특성 분석이 수행됩니다.
GMP 등급은 플라스미드가 모든 임상 시험에서 의약 원료(drug substance)로 사용되거나 임상 2상/3상 시험의 시작 물질(starting material)로 사용될 때 요구됩니다. (개요 섹션의 그림 참조) 제조 및 정제된 플라스미드는 물리적 상태, 동일성, 함량, 순도/불순물, 안전성에 관련된 특성을 포괄하는 완전한 품질 관리 세트를 통해 특성화됩니다. (아래 표 참조: 플라스미드의 각 품질 등급별 품질 관리 목록) 대부분의 시험은 공정서(compendial) 기반이므로 표준화되어 있으며, 일부 특정 시험(예: HPLC를 이용한 플라스미드 위상 분석)의 적격성(qualification)은 별도로 고려되어야 하며, 이는 Xpress Biologics에서 제공합니다.
AAV 벡터에 존재하는 역방향 말단 반복 서열(ITR)은 벡터 생산 과정에서 게놈 복제와 패키징을 유도하는 데 필요합니다. ITR 서열은 보통 헤어핀 구조를 형성하여 플라스미드의 전하 밀도를 변화시키며, 이로 인해 크로마토그래피 과정에서의 거동이 달라지고 정제 효율이 감소할 수 있습니다. 이는 ITR 서열의 존재로 인해 슈퍼코일(SC) 형태와 오픈-서큘러(OC) 형태의 전하 밀도가 유사해지기 때문입니다. 따라서 크로마토그래피 조건을 수정하여 두 이소폼을 성공적으로 분리할 수 있도록 하였으며, 이를 통해 규격(˃95%)에 부합하는 SC 형태의 일정 비율을 회수할 수 있게 되었습니다.
반복 서열(예: LV 벡터의 LTR 서열)의 존재는 증폭 단계에서 재조합 사건을 촉진할 수 있습니다. Xpress Biologics는 이러한 재조합 사건을 방지하면서 산업적 및 경제적 제약에 부합하는 수확 시 플라스미드 수율을 가능하게 하는 발효 공정을 개발했습니다. 또한, 당사의 분석 방법은 반복 서열을 포함한 플라스미드의 전체 서열 분석을 가능하게 하여 잠재적인 재조합의 부재를 검증할 수 있습니다.
지난 3년 동안 Xpress Biologics는 LV(렌티바이러스) 생산에 특화된 플라스미드 제조 프로젝트를 약 30건 수행했으며, 이는 R\&D, HQ, GMP 등급의 로트를 포함하여 50개 이상의 배치에 해당합니다.
지난 3년 동안 Xpress Biologics는 AAV 생산에 특화된 플라스미드 제조 프로젝트를 약 20건 수행했으며, 이는 R\&D 및 HQ 등급을 포함한 총 30개의 배치에 해당합니다.
Xpress Biologics는 플라스미드 서열 내 최대 120 뉴클레오타이드 길이의 poly(A) tail 존재를 고려하여 제조 공정(주로 발효)을 조정하였으며, 이러한 플라스미드를 성공적으로 생산하고 정제해왔습니다. 고객이 선형화를 요청하는 경우, 소화 조건(digestion conditions)을 최적화하기 위한 타당성 조사를 제안하며, 이를 통해 제한효소 사용량을 줄이고 생산 예산을 절감하는 것을 목표로 합니다.
Xpress Biologics가 개발한 정제 프로토콜(뉴클레아제 부재) 덕분에 높은 순도를 달성하기 때문에, 플라스미드의 안정성은 매우 우수하게 나타납니다. 냉동 보관 시 -20°C 또는 -80°C에서 보관할 경우 3년 이상 안정성이 유지됩니다. 냉장 및 실온 보관 시 4°C 또는 실온(RT)에서도 안정성이 양호하게 유지됩니다. 또한 최근 수년간 축적된 경험을 기반으로, Xpress Biologics는 장기 안정성을 보장하기 위해 적합한 제형 완충액의 종류에 대해 고객에게 조언할 수 있습니다. 만약 신약 허가 신청용 자료 제출 등과 같이 추가적인 지원이 필요한 경우, ICH 가이드라인에 따라 장기 안정성 연구를 개시할 수도 있습니다.
네, 저희는 혁신적인 조립 기술인 e-Zyvec® 기반의 플라스미드 엔지니어링 서비스를 제공합니다. 온라인 소프트웨어와 전문 플라스미드 엔지니어 팀을 통해, 귀하의 응용 목적에 적합하면서도 대규모 생산 요건에 부합하는 플라스미드 특성을 정의할 수 있도록 지원해 드립니다.
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