유전적 안정성 시험
유전적 안정성 분석: 특성분석 및 안정성 시험
바이오 의약품의 생산에 사용되는 세포에는 ‘유전적 안정성’이라는 특성이 있습니다. 유전자 변형 세포의 경우에는 유전자의 변형을 위한 해당 단백질의 코드를 입력하기 위한 외부유전자 삽입 서열이 존재하는데, 이 외부유전자는 변이가 가능하기 때문에 제품의 품질, 내지는 공정의 올바른 이행 여부에 영향을 미칠 소지가 있습니다.
이와 같은 이유로, ICH 가이드라인에서는 유전자 삽입의 안정성과 무결성을 확인, 정확한 단백질이 안정적으로 생산될 수 있도록 할 것을 권고하고 있으며, 이 권고 사항 이외에도 여러 가지 조건을 충족하여야만이 세포주와 생산 시스템이 ICH 가이드라인에 부합하도록 할 수 있습니다.
한편, 세포주의 유전적 안정성을 결정하는데 있어서는 다양한 기술을 적용할 수 있는데, 생산세포주의 특성분석 시 MCB와 EoPCB의 유전적 안정성을 확인하기 위해 이와 같은 기술을 활용하게 됩니다. 반드시 그러한 것은 아니나, 보통 이와 같은 시험은 발효공정상의 변화가 있게 되는 단계에 행할 때에 특히 유용합니다.
싸토리우스에서는 다음 중 고객사의 제품에 가장 적합한 방법으로 유전적 안정성 분석 서비스를 제공하고 있습니다.
세포주 식별 시험 (DNA 바코딩, RAPD 분석)
유전자 복제수 확인
외부유전자 염기서열 분석
서던 블로팅
고객사에서 준수하여야 하는 규제에 가장 적합한 분석법을 싸토리우스에서 제안하여 드립니다.
싸토리우스 플랫폼을 기반으로 고객사 제품의 유전적 안정성을 테스트하실 수 있는 유전자 염기서열분석 기법을 개발하여 드립니다.
싸토리우스의 분석법은 cGMP 적합 분석법으로 유럽약전(EP)과 미국약전(USP) 가이드라인을 준수합니다.
| 싸토리우스의 유전적 안정성 분석, 특성분석 솔루션 | 목적 |
|---|---|
DNA 바코딩 분석 | 적은 수의 유전자 영역에서 유래한 정보 만으로도 종 수준에서의 세포주 식별이 가능합니다. |
무작위 증폭 다형성 DNA 분석(RAPD) | 변이, 오염 세포를 식별하여, 통상적으로 연구용 세포은행. 마스터 세포은행, 제조용 세포은행, 생산종료 세포은행의 비교에 활용됩니다. |
유전자 복제수 확인 | 세포당 외부유전자 복제수를 확인하기 위한 목적으로 제조된 재조합 세포은행에서 유전자 복제수를 확인합니다. |
ABI 3500 플랫폼을 활용한 생어 염기서열 분석 | 단백질의 생산에 사용할 외부유전자의 핵산 염기서열과 측면 영역의 염기서열에 기초하여 세포주의 안정성을 확인합니다. |
서던 블로팅 | 서던 블로팅을 실시하여 생산세포 DNA의 소화 시 외부유전자의 존재를 식별함으로써 DNA의 무결성을 입증합니다. |
싸토리우스에서는 세포주 식별에 다음의 두 가지 방법을 사용하고 있습니다.
- DNA 바코딩 분석
- 무작위 증폭 다형성 DNA 분석(RAPD)
세포주 특성의 식별을 위한 DNA 바코딩 분석
싸토리우스는 cGMP 세포주 특성을 분석할 수 있는 DNA 바코딩 서비스를 제공합니다. 싸토리우스의 DNA 바코딩 서비스를 이용하시면 ICH, CBER, FDA 가이드라인에 따른 포유류 유래 세포주의 종단위 식별이 가능합니다. 각국 규제기관에서 인정받은 DNA 바코딩 분석법은 DNA 종을 식별, 결정하는데 있어 가장 선호되는 방법으로 알려져 있습니다.
싸토리우스의 DNA 바코딩 분석법은 HeLa, HEK-293, MRC-5, CHO-K1, Vero, A9, MA104, MDBK 세포주에 사용할 수 있습니다.
무작위 증폭 다형성 DNA 분석(RAPD)
RAPD DNA 바코드 분석법에 대안적으로 활용할 수 있는 세포주 식별검사법으로, 타겟 게놈의 영역을 증폭하는데 있어 6종의 프라이머 세트를 사용하는 방식의 분석법입니다.
단백질의 생산에 사용할 외부유전자의 핵산 염기서열을 분석하는 것은 세포주의 유전적 안정성을 결정하는데 있어 핵심적인 공정입니다.
재조합 단백질 의약품 개발 초기에는 마스터 세포은행(MCB)과 생산종료 세포은행(EoPCB)을 위한 외부유전자의 메신저 RNA(mRNA) 염기서열을 확인하고, 이를 통해 유전자코드 상의 변화가 없고 중대한 세포 상의 변화가 없었음을 확증하는 절차를 밟게 됩니다.
또한 생산성과 발현도에 영향을 미칠 수 있는 또 다른 요인인 외부유전자의 측면 영역 또한 주요하게 고려되어야 할 사항이며, ICH 가이드라인에 따르면 측면 영역의 (DNA 단위) 염기서열 분석은 3상 임상시험에 돌입하기 전 까지 이루어져야 합니다.
핵산 염기서열 분석 부문에서 25년 이상의 경험을 쌓아온 싸토리우스는 전통적인 생어 염기서열 분석 시 ABI 3500 플랫폼을 활용, 인간세포와 CHO 세포에서 유래한 재조합단백 등 다양한 유기체와 샘플 유형에 대응할 수 있도록 대비하고 있습니다.
싸토리우스의 염기서열 분석 서비스의 구성은 다음과 같습니다.
- 고수율 염기분석
- 유전체 / 게놈영역 재해석
- 싱글리드 / 멀티리드 서열분석
- 프라이머 설계
- PCR 증폭, 정제
가장 전통적인 DNA 분석법 중 하나인 서던 블로팅은 겔 전기 영동법을 이용, 절편의 크기 기준으로 DNA를 분리, 분석하는 방법입니다. DNA가 분리되면 핵산탐침으로 특정 DNA 타겟 영역을 식별할 수 있습니다.
서던 블로팅을 실시하면 생산세포 DNA의 소화 시 외부유전자의 존재를 식별할 수 있습니다. 생산세포주 외부유전자의 복제수가 복수인 경우에는 서던 블로팅을 실시하면 각 타겟 염기서열을 식별할 수 있습니다. 하나 이상의 삽입 서열이 서로 인접하여 위치하게 되는 경우, 염기서열이 게놈을 따라 산포되거나 band가 더 길게 관찰되게 될 것이기 때문입니다.
이는 즉 서던 블로팅을 통해 외부유전자의 복제수에 관련한 개략적인 정보를 파악할 수 있음은 물론, 같은 블랏의 MCB / EoPCB의 샘플을 비교하여 유사성을 입증할 수도 있습니다.
외부유전자 복제수를 확인하는 것은 CHO 세포주 등 재조합 단백질 생산에 사용되는 세포주의 생산성을 확인하는데 있어 핵심이 되는 공정입니다.
세포주 생산성이 일관된 수준으로 유지되기 위하여는 외부유전자 복제수가 일관되어야 합니다. 생산성이 저하된 세포주의 경우, 계대배양 중에 변이가 관찰되게 됩니다. 특히, 클론의 복제수를 결정하는데 있어서는 정량적 PCR이 가장 적합한 방법입니다. 싸토리우스에서는 분석법의 설계에서부터, 샘플의 품질인증을 통한 밸리데이션까지 토털 서비스를 제공하고 있습니다.
