생물리 특성분석
단백질 기반 치료제는 살아있는 세포에서 제조하는 특징이 있는 만큼 구조적인 이질성을 본질적으로 수반하게 되어 있으며, 단일클론항체 치료제의 개발에 있어 이와 같은 구조적 이질성을 특성분석 하는 것은 필수적으로 수행되어야 할 공정입니다. 특히, 치료제의 체내 안정성에 영향을 미쳐 생물활성 소실, 의도되지 않은 면역반응을 초래할 수 있는 번역 후 변형의 문제도 주목하여야 할 사안입니다.
싸토리우스에서는 치료적 단백질 개발 파이프라인 중 적정 시점에 물리화학적 분석을 실시함으로써 단백질 구조를 확인, 이와 같은 위험을 경감할 수 있는 다양한 솔루션과 자문 서비스를 제공하고 있으며, 구체적으로는 최신 기술을 기반으로 한 단백질 구조, 탄수화물 프로파일, 번역 후 변형의 특성분석을 바탕으로 ICH Q6B 가이드라인 준수를 보장, 가장 효과적인 개발공정을 중단 없이 수행할 수 있도록 고객사를 보조하고 있습니다.
고객사 기존 프로그램의 어떤 단계에서든 정상 단백질의 당형(glycoform)을 평가할 수 있는 세 가지 방법론 제공
구조적 / 물리화학적 특성분석법에 고도의 바이오분석을 병합 실시함으로써 완벽한 단백질 특성분석 수행 가능
IgG와 같은 표준 분자에 대한 분석법의 적격성을 사전에 확인, 고객사 공정에 신속하게 도입 가능
초기 클론 특성분석에서 cGMP 준수 출하승인까지, 각 단계별 맞춤형 솔루션을 제공합니다.
ICH Q6B 기준 | 싸토리우스의 솔루션 |
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탄수화물 구조 |
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아미노산 서열 |
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| 아미노산 조성 | 아미노산 분석 |
말단 아미노산 서열 | 펩타이드 매핑 |
펩타이드 맵, 번역 후 변형 |
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술프하이드릴기 및 이황 가교 | 비환원 펩타이드 맵핑 |
번역 후에 단일클론항체에 결합되는 것을 특징으로 하는 글리칸 구조가 많을 수록 분자구조, 이펙터 작용, 안정성 등 몇 가지 특성의 분석에 미쳐지는 영향도 또한 크며, 그에 따라 항체치료제의 개발에 수반되는 어려움도 커지게 됩니다.
LC/MS법 기반 N-글리칸 분석
싸토리우스는 IgG 당화를 고도로 프로파일링 할 수 있는 N-글리칸 분석법을 지원합니다. 효소작용으로 인해 항체에서 제거된 글리칸은 라벨링을 거쳐 고해상도 액체 크로마토그래피(LC) 분리법으로 분석하게 됩니다 (크로마토그램 그래프 자료 참고).
다양한 글리칸 구조를 정확하게 정량해 내기 위해서는 형광 검출법과 On-line ESI 질량 분광분석법(MS)을 병행 실시한 후, 정량이 완료된 글리칸 구조 간의 유사성을 기준으로 군 별 (복잡성이 높은 구조, 올리고만노스 구조 등), 단당조성 별 (푸코오스, 갈락토오스, 시알릭산 프로파일 등)로 구분합니다.
이렇게 도출된 크로마토그램에서는 적합성(GOF) 피크값인 100%에서의 주 당형(glycoform)을 식별해 낼 수 있습니다.
펩타이드 매핑은 단백질의 1차 구조 (즉, 아미노산 염기서열)를 확인하기 위한 가장 주요한 방법입니다. 단백질의 소화는 단백질 분해효소에 의해 이루어지며, 그 결과로 결합이 분해된 펩타이드는 액체 크로마토그래피법과 질량 분광분석법(LC-MS)으로 분석할 수 있게 됩니다. 단백질을 효과적으로 소화시킬 수 있는 방법론, 초고성능 LC 분리, 고해상도 MS법이 조합된 싸토리우스의 펩타이드 매핑법을 도입하면 이와 같은 고도의 단백질 특성분석이 가능합니다.
다양한 단백질 소화 방법론
펩타이드 매핑 시에는 일반적으로 트립신을 단백질분해효소로 사용합니다. 트립신의 라이신, 아르기닌 잔기에 대한 특이성이 우수하기 때문입니다. 그러나 트립신 만으로는 단백질의 염기서열 전체에 대한 소화를 유도할 수 없을 때, 또는 트립신 활성에 대항하는 내성이 있는 단백질인 경우에는 다른 단백질소화효소를 사용할 필요가 있습니다.
펩타이드 매핑에는 트립신에 대한 특이성 (orthogonal specificity)이 있는 여러가지 다양한 단백질 분해효소를 사용할 수 있습니다. 이는 중복펩타이드 (overlapping peptide)를 사용함으로써, 소위 펩타이드 프래그멘테이션 경로(PFP)를 달리하여 염기서열을 보다 확실하게 규명하기 위함입니다.
펩타이드 매핑은 단백질의 1차 구조를 구성하는 아미노산의 염기서열을 확인할 때 적합한 방법입니다. 단백질 분해효소를 사용하여 단백질을 소화시킨 후에 잔류하게 되는 펩타이드는 질량 분광분석법(LC-MS)으로 분석해 낼 수가 있습니다. 단백질을 효과적으로 소화시킬 수 있는 방법론, 초고성능 LC 분리, 고해상도 MS법이 조합된 싸토리우스의 펩타이드 매핑법을 도입하면 이와 같은 고도의 단백질 특성분석이 가능합니다.
번역 후 변형
번역 후 변형(PTM)의 분석적 특성분석을 목적으로 하는 펩타이드 매핑은 단백질 구조 분석의 필수 공정입니다. 펩타이드 매핑으로 분석할 수 있는 특성으로는 탈아미노화, 산화, N-말단 피로글루탐산, C-말단 리신 클리핑, 당화 등이 있습니다.
