신경변성 질환 관련 개요

그림 1. 체외 만성질환 모델에서 응집성 타우 펩타이드 처리가 신경돌기 길이에 미치는 영향 랫드의 일차 피질 뉴런 (싸토리우스 rCortical)을 PDL(0.1 mg/mL)로 코팅한 96-웰 플레이트에 시딩 (웰 당 20,000개 세포)한 후, 시딩 시점으로부터 8일 후에 용해화 된 타우 또는 응집된 타우로 세포를 처리 (헤파린 비 4:1, 37°C, 5일간 sporadic rotation) 한 후 Incucyte^®에서 분석하였습니다. 영상은 자동 세그먼테이션 하여 신경돌기 성장 길이를 정량 하였습니다. 응집된 타우로 처리한 경우 신경돌기 성장 길이가 농도 의존적으로 짧아졌고 (80 ± 5 vs. 166 ± 3 %, 2 ~ 3 반복), 응집되지 않은 타우는 같은 50µg/mL에서 신경돌기 형성만을 상당 수준 저해한 것을 확인할 수 있습니다.

그림 2. 동역학적 파킨슨병 모델에서 옥시도파민(6-OHDA) 처리로 세포 사멸율은 높이고 신경돌기 성장 길이는 단축된 예시 - 그림은 랫드 선조체와 성상교세포의 공동 배양물을 PDL로 코팅한 96-웰 플레이트에 시딩 (웰 당 각각 20,000개, 15,000개 세포)한 후 싸토리우스 Incucyte^® Neurolight-Orange로 감염시키고, 10일 후에 세포사멸 마커인 싸토리우스 Incucyte^® Annexin V Green (0.5%)가 함유된 배지를 옥시도파민(6-OHDA)으로 처리 (2 ~ 500 µM)한 결과입니다. 좌측의 형광 이미지는 싸토리우스 Incucyte^® 실시간 세포분석 시스템으로 확보한 것으로, 4개 이미지는 각각 6-OHDA 처리 시 (19µM, 56µM, 167µM)와 부형제 처리 시점 기준 21일차에 확보한 것입니다. 우측의 시간 경로 프로파일 약물 반응 곡선 모두에서 농도 의존적인 신경돌기 길이는 줄어드는 반면 Annexin V의 신호는 커지는 것이 관찰되므로 처리한 약물의 영향을 확인할 수 있습니다. 플롯 된 데이터는 평균 ± 표준 오차 (3 반복)입니다.

그림 3. 파킨슨병 모델에서 약물 활성도의 뇌 영역별 특이성 6-OHDA는 피질에서보다 흑색질과 선조체에서의 신경돌기 성장에 선택적으로 영향을 미칩니다. 그림은 각각 랫드 선조체 뉴런과 흑색질 뉴런 또는 피질 뉴런과 성상교세포의 공동 배양물을 PDL로 코팅한 96-웰 플레이트에 시딩 (웰 당 각각 20,000개, 15,000개 세포)한 후 싸토리우스 Incucyte^® Neurolight-Orange로 감염시키고, 이를 10일 후에 6-OHDA으로 처리 (56 ~ 500 µM)한 결과입니다. 좌측의 형광 이미지는 싸토리우스 Incucyte^® 실시간 세포분석 시스템으로 확보한 것으로, 막대 그래프와 약물 반응 곡선 모두 뇌의 서로 다른 영역에서, 각기 다른 6-OHDA 농도에서 선택적으로 신경돌기 길이에 영향을 미치는 것으로 나타납니다. 부형제 데이터의 경우 뇌의 영역에 따라 신경돌기 형성 자체에 차이가 있음을 보여줍니다. 플롯 된 데이터는 평균 ± 표준 오차 (3 반복)입니다.

그림 4. 연결성이 유지된 상태에서의 타우 유도 신경 활성 저해 기능 평가 랫드 피질 뉴런과 랫드 성상교세포 (싸토리우스 Neuroprime^®)의 공동 배양물을 PDL로 코팅한 96-웰 플레이트에 시딩 (웰 당 각각 25,000개, 15,000개 세포)한 후 그림은 유전적으로 암호화된 칼슘 지표자인 싸토리우스 Incucyte^® Neuroburst-Orange로 뉴런을 감염시켜 칼슘치 변동을 측정함으로써 자발적인 신경학적 활동을 모니터링 한 결과입니다. 이미지는 싸토리우스 Incucyte^® 시스템 상에서 매 24시간 마다 (초당 3 프레임으로 3분 간 스캔) 촬영하였습니다. 성숙 단계인 14일 차에 기능망이 형성되었으며, 이 때 알츠하이머 연관 펩타이드 타우 (응집되지 않은 타우, 300μg/mL) 또는 단백질 인산가수분해효소 저해제 (OKA, 50nM)로 세포를 처리하였습니다. 각 형광 사진은 전체 스캔 시간 중 활성 범위 (최대 / 최소 형광)를 나타내고, 칼슘 trace는 field of view(FOV) 내의 모든 활성 객체에서 칼슘의 변동을 나타내며, 막대 그래프는 활성 객체의 수 (1/image)와 그 상관관계 (연결성)를 정량한 것입니다. 이들 데이터로 미루어보아 부형제 대비 타우 처리 시 활성 노드가 줄어들었고 (이미지 당 1407 ± 94 객체 vs. 920 ± 43 객체) 그 평균 강도 또한 낮아졌으며 (13.7 ± 1.7 OCU vs. 7.2 ± 3.6 OCU) 상관관계에 대한 영향은 없었음 (0.95 ± 0.01 vs. 0.97 ± 0.01, 2 반복)을 확인할 수 있는 반면, OKA의 영향으로 활성 노드의 수가 줄어들었고 (이미지 당 180 ± 24 객체) 그 평균 강도 (3.8 ± 0.3 OCU)와 상관관계 (0.27 ± 0.02, 6 반복)도 낮아졌음을 확인할 수 있습니다 (그래프에 플롯 된 데이터는 평균 ± 표준 오차입니다).

그림 5. 알츠하이머 환자 유래 2D, 3D iPSC 모델에서 특이적인 신경돌기 발달과 구상체 형성 확인 - 정상인과 알츠하이머 환자 (PSEN1 변이)에서 각각 유래한 iPSC 뉴런 (Axol Bioscience)을, 2D의 경우에는 ReadySet + SureBond으로 코팅한 플레이트에 시딩 (웰 당 25,000개 세포), 3D의 경우에는 ULA 96-웰 플레이트 (웰 당 50,000개 세포)에 각각 시딩한 후 원심분리 (250g, 10 분)하고, 3D의 경우 구상체가 형성될 수 있도록 3일을 추가로 대기하여 공급자 프로토콜 대로 뉴런 분화를 유도한 사례입니다 (배지 첨가제 A+B). 2D 분석: Incucyte^® 소프트웨어 분석 모듈로 최대 15일 간 신경돌기 발달을 자동 정량한 결과, 환자 유래 iPSC 세포주에서 신경돌기 길이가 상대적으로 짧은 (48 ± 3 mm/mm2 vs. 80 ± 3 mm/mm2, 3 반복) 것을 시간 경로 프로파일 상에서 확인할 수 있습니다. 3D 구상체 분석: 비교란(non-perturbing)성 시약을 활용하여 구상체 크기를 브라이트 필드로 최대 15일 간 정량 하는 과정에서, 6일 차 시점에서 특정 웰에 Matrigel^® (2.25 mg/mL)을 추가한 후 구상체의 형태학적 분석과 발달 추이를 이후 9일 간 관찰하였습니다. 그 결과 환자 세포주와 정상인 세포주 간 구상체 크기와 발달 추이에서 상당한 차이를 보임을 시간 경로 프로파일 상에서 확인할 수 있습니다.