신경아교세포 특성분석
성상교세포, 미세아교세포, 희소돌기 아교세포 등과 같은 신경아교세포는 항상성 유지, 시냅스 생성, 뉴런의 보호와 지지 등 중추신경계에서 중요한 역할을 담당하는 물질입니다. 인간의 건강과 질병에 있어 신경아교세포가 어떠한 역할을 하는지에 관한 사항은 최근에 들어 중심적인 연구 분야가 되었으며, 신경아교세포를 중심으로 한 솔루션과 연구 방법론도 활발하게 개발되고 있습니다. 이처럼 기초 연구 단계와 번역 연구 단계 모두에서 배양물 또는 iPSC를 사용하여 신경아교세포를 배양하는 것은 인간의 질병을 연구, 조사하는데 있어 유용성이 있는 것으로 인식되고 있지만, 그 분석 모델은 공정 End Point에서의 형태학적 분석법과 면역 병리학적 분석법에 그치고 있는 실정입니다. 이에, 기술적 솔루션과 체외 번역 모델을 바탕으로 중추신경계 질환에서 신경아교세포의 증식과 그 기능, 형태학적 특성 및 역할론에 대한 이해도를 지금보다 향상시킬 수 있는 소지가 있습니다.
신경아교세포의 증식과 형태학적, 약리학적 특성의 정량적 분석
뇌의 서로 다른 영역에서 동역학적 특성을 고수율로 모니터링 할 수 있는 솔루션
그림 1. 뇌 내 성상교세포의 시계열 모니터링을 통한 세포 증식과 형태학적 변화 관찰 - 그림은 피질, 해마, 소뇌 성상교세포를 각각 96-웰 플레이트에 시딩 (웰 당 2,000개 세포)한 후 30 ~ 40%의 세포 컨플루언스(피질 2일, 해마 및 소뇌 4일)로 배양하여 세포 확산도와 형태학적 변화를 10일 간 모니터링 한 결과로 분지된 형태학적 표현형을 정량 한 것 (분홍색 그래프, 갈색 그래프)입니다. 뇌의 각 영역에서 각 세포가 증식하는 정도를 시간 경로 프로파일로 비교한 결과, 피질에서의 성상교세포 증식이 가장 빠른 것을 확인할 수 있습니다. 시간이 경과함에 따른 신경아교세포의 분지 추이를 분석한 결과, 96시간 시점에서 소뇌 성상교세포의 분지가 가장 활발한 분지 추이를 보였고 (68.3 ± 1.8), 다음으로는 해마 (50.6 ± 1.5), 피질 (12.3 ± 0.7)순 입니다. 한편, 웰 별 최대 분지는 우측의 변이성 플롯 그래프에서 확인할 수 있습니다. 플롯된 데이터는 평균 ± 표준 오차 (24 반복)이며, 10배율 이미지를 기준으로 하였습니다.
소뇌 성상교세포에서 이오노마이신의 약리학적 영향
그림 2. 이오노마이신으로 유도된 칼슘 증가가 소뇌 성상교세포의 건강도와 증식에 미치는 영향 - 그림은 소뇌 성상교세포를 96-웰 플레이트에 시딩 (웰 당 10,000개 세포)한 후 칼슘 이오노포어 이오노마이신 (0.01 ~ 10 µM)으로 처리한 후, 세포 건강도 시약인 싸토리우스 Incucyte® Annexin V NIR (0.5%)를 첨가한 배지에서 배양한 결과입니다. 세포 확산도와 형태학적 변화를 10일 간 모니터링 한 결과, 시간 경로 프로파일 상 이오노마이신이 세포 증식에 동역학적 영향을 미침을 확인할 수 있습니다. 이오노마이신이 세포 증식과 건강도에 미치는 영향을 비교하는 농도 반응 곡선에서는 컨플루언스는 농도 의존적으로 감소했고 세포사멸은 농도 의존적으로 증가했으므로, 이오노마이신의 독성 영향이 확인됩니다. 하단의 대표 이미지는 24 시간 시점에서의 세포 증식 (상 분석), 세포 건강도 (근적외선 분석)을 나타내는 것입니다. 플롯된 데이터는 평균 ± 표준 오차 (3 반복)이며, 10배율 이미지를 기준으로 하였습니다.
다중 분석 기법을 통해 보다 깊이 있는 인사이트 도출 가능
비교란(non-perturbing)성 시약을 활용한 세포 주기의 진행과 조절, 세포 생존성의 모니터링을 통한 복잡한 세포 기능조절 특성 분석
그림 3. 오카다 산(OKA)으로 유도한 세포 주기 교란과 성상교세포주에서의 세포사멸 간의 구분 - 그림은 T98G 성상교세포주를 발현하는 싸토리우스 Incucyte® Cell Cycle Green|Orange 렌티바이러스를 96-웰 플레이트에 시딩 (웰 당 4,000개 세포)하고 단백질 인산가수분해효소 저해제로서 OKA를 처리 (50 ~ 0.14 nM)한 후, 세포 건강도 시약인 싸토리우스 Incucyte® Annexin V NIR (0.5%)를 첨가한 배지에서 배양, 세포 주기 교란과 세포 주기 생존성을 확인한 결과입니다. 좌측의 대표 이미지는 싸토리우스 Incucyte® Cell-by-Cell 분석 모듈의 세포영상 세그먼테이션 기법으로 확보한 10배율 이미지로, 부형제와 OKA에 대한 대표상과 형광상 (녹색, 황색, NIR)의 Phase Video를 2일의 후처리 기간에 걸쳐 확보하였습니다. S|G2|M (녹색) 또는 G1 (황색)에서의 세포 군집수와 Annexin V 양성 세포 (청색)의 시간 경로 프로파일 상, S|G2|M에서 OKA(5.56 nM)가 세포 주기 교란을 16 시간 내 유발하여 36 시간 시점까지 지속되었고 그 이후 사멸 세포의 수가 증가함을 확인할 수 있습니다. 농도 반응 곡선에서는 서로 다른 상에서의 세포 군집수를 확인하였을 때 OKA의 속효성이 확인 (20 시간 시점)되었으며, Annexin V Positive에 의한 세포 생존성 연장 효과가 48 시간 시점 까지 확인 되었습니다. 플롯된 데이터는 평균 ± 표준 오차 (6 반복)입니다.
신경아교세포 움직임의 시각화 및 정량 분석
실시간 세포 이동성 측정 전자동 분석 실시간 손상 후 평가
그림 4. 서로 다른 뇌의 영역에서 손상 후 성상교세포 이동과 약리학적 저해 일차 성상교세포 (피질, 해마, 소뇌) 또는 iPSC (CDI, Fujifilm) 성상교세포를 싸토리우스 Incucyte® ImagelockT96-웰 플레이트에 시딩 (웰 당 30,000개 세포)한 후, 싸토리우스 Incucyte® Woundmaker를 사용하여 정밀하고 재현성 높게 상처를 만들어 내었습니다. 그림은 싸토리우스 Incucyte® 실시간 세포분석 시스템으로 확보한 것입니다. Phase Video 상 배양된 해마 성상교세포의 이동이 손상 후 3일 간 관찰되며, 최초 손상 (청색)과 상처 회복 과정 중 상처 (황색)를 바탕으로 세포의 형태학적 변화를 평가할 수 있습니다. 시간 경로 프로파일 상 뇌의 서로 다른 영역에서 상처 회복률을 비교한 결과, 소뇌 성상교세포의 이동이 가장 빠른 것으로 확인되었습니다. 또한 상처 발생 전 피질 성상교세포를 이오노마이신 (10 ~ 0.01 µM)에서 배양한 약리학적 연구에서는, 세포 이동이 농도 의존적으로 저해되었습니다 (IC50 = 1.67 µM). 플롯된 데이터는 평균 ± 표준 오차 (24 반복)입니다.
신경아교세포 화학주성의 실시간 정량
그림 5. FBS 쪽으로의 T98G-WT 성상교세포 화학주성 이동 Incucyte® ClearView 96-Well Chemotaxis의 플레이트를 PDL(0.1 mg/mL)로 코팅한 후 상부 챔버에 배열 (웰 당 1,000개 세포)하고, 세포가 충분히 부착되면 화학주성 유인물질인 소태아혈청(FBS; 10 ~ 0.12%)을 하부 챔버에 첨가합니다. 좌측은 각각 멤브레인의 상, 하부를 FAB 첨가 48 시간 시점에 도출한 이미지, 우측의 데이터는 48 시간 시점에서의 시간 경로 프로파일 그래프와 막대 그래프로, FBS 쪽으로의 화학주성 이동이 FBS 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있습니다(EC50 = 3%). 플롯된 데이터는 평균 ± 표준 오차 (10 반복)입니다.
생리학적 연관성이 높은 신경아교세포 모델 활용
iPSC 유래 세포 또는 일차 세포 모델 등 연관성이 높은 세포 모델 단독 배양 또는 공동 배양하여 성상교세포 등 신경아교세포의 보조적 기능을 연구하십시오.
그림 6. 뉴런 공동 배양에서, 신경돌기 발달과 신경망의 안정화 측면에서의 iPSC 성상교세포의 기능 인간 iPSC 유래 뉴런을 단독 배양 시딩 또는 Talisman Therapeutics 성상교세포와의 공동 배양 (웰 당 뉴런 25,000 단위, 성상교세포 10,000 개) 시딩한 후, 싸토리우스 Incucyte® Neurolight, Incucyte® Neuroburst Orange로 뉴런을 감염시켜 각각 신경돌기의 발달 정도, 자발적인 신경학적 활동을 평가하였습니다. 시간 경로 프로파일 상, 단독 배양 시 대비 공동 배양 시에서 신경돌기의 분지와 성장이 활발했음을 확인할 수 있습니다 (228 시간 시점에서, 147 ± 2.5 vs. 72 ± 2.5 mm/mm2). 한편 trace는 field of view(FOV) 내의 모든 활성 객체에서 칼슘의 변동을 나타내며, 막대그래프는 23일 시점에서 정량 결과, 상관관계(연결성), burst rate, burst duration을 나타내는 것인 바, 공동 배양 시 활성 객체의 수가 증가하고 칼슘 변동 간의 주기가 긴 것으로 보아 연결성에 어떠한 영향도 없이 단독 배양 시 대비 신경망이 안정함을 확인할 수 있습니다. 이와 같은 결과로 미루어 볼 때, 공동 배양에서 iPSC 성상교세포는 뉴런의 형태학적 표현형의 측면에서 기능적 성숙도가 높은 신경망을 형성하는데 도움을 준다는 결론을 얻을 수 있습니다. 플롯된 데이터는 평균 ± 표준 오차 (24 반복)입니다.
주문 정보
제품 구분 | 수량 | Cat. No. |
|---|---|---|
Incucyte® 화학주성 분석 소프트웨어 모듈 | 1 | 9600-001 |
Incucyte® Clearview 96-웰 화학주성 플레이트 | 1 | 4582 |
Incucyte® Scratch Wound 세포 이동 소프트웨어 모듈 | 1 | 9600-0012 |
Incucyte® Scratch Wound 세포 이동 키트 | 1 | 4493 |
Incucyte® Scratch Wound 세포 침윤 액세서리 | 1 | 4444 |
Incucyte® Imagelock 96-웰 플레이트 | 1 | 4444 |
Incucyte® Cell Cycle Red/Green 렌티바이러스 시약 | 1 바이알 (0.2 mL) | 4779 |
Incucyte® Cell Cycle Green/Orange 렌티바이러스 시약 | 1 바이알 (0.2 mL) 1 바이알 (0.2 mL) | 4809 |
Incucyte® Cell-by-Cell 분석 소프트웨어 모듈 | 1 모듈 | 9600-0031 |
