보체의존 세포독성(CDC) 분석용 고성능 유세포분석

그림 2. 96웰 또는 384웰 플레이트로 효율적인 mAb의 CDC 작용 스크리닝

Ramos 세포(5K/웰)를 여러 농도(mAb당 농도 12단계, 반복실험 3회)의 항CD20 항체(표1 목록 참조)와 함께 15분 동안 배양한 뒤 CDC 유도를 위해 인간 항체(15%)를 첨가하고 다시 30분간 배양했습니다. 그 다음, 세척한 세포를 iQue^® 세포막 완전성(R/Red) 염료로 라벨링했습니다. 왼쪽 히트 맵은 웰당 생존한 Ramos 세포의 비율을 나타냅니다(옅은 회색일수록 살아 있는 세포의 비율이 낮음). 

리툭시맙과 트룩시마를 가열한 경우 CDC 유도가 크게 감소했고, EC₅₀은 가열한 mAb에서 가장 컸습니다. 반대로 비치료용 항CD20은 열처리 후 EC₅₀이 2배 감소하여 가열에 더 큰 저항성을 보였습니다. 비치료용 항CD20의 비푸코실화 형태의 경우 기준 항체보다 높은 CDC 작용을 나타냈습니다.  

그림 3. 하나의 웰로 여러 종류의 세포 간 CDC 작용 비교

(A) 3종의 부유세포에 대해 CD20 발현을 프로파일링했습니다. Ramos 세포의 발현이 가장 높았고, 그 다음은 Raji 세포였습니다. Jurkat은 CD20에 음성으로, IgG 배경 대조군과 비슷한 발현 수준을 보였습니다.

(B) 히스토그램에서 볼 수 있듯 CDC 분석을 위해 Raji 세포(iQue^® 세포 확산 및 라벨링(V/Blue) 염료로 밝게 염색), Ramos 세포(라벨링 염료로 어둡게 염색), Jurkat 세포(무표지)를 혼합(5K/웰)한 뒤 라벨링 염료 형광을 바탕으로 분리했습니다.

(C) 리툭시맙(항CD20-IgG1)에 의한 CDC 유도 수준은 세포 종류에 따라 다르게 나타났으며 CD20과 상관관계를 보였습니다. 예를 들어, Ramos 세포는 CD20이 가장 높게 나타났고 리툭시맙에 의한 CDC에 가장 취약했습니다. 

그림 4.  부유세포나 부착세포 모델을 사용해 여러 mAb로 CDC 작용 측정

비부착세포(CD20 양성 Ramos 세포와 CD20 음성 Jurkat 세포) 또는 부착세포(Her2 양성 AU565 또는 Her2 음성 MDA-MB-468)를 혼합해 CDC를 분석했습니다. 두 경우 모두 항원에 음성인 세포를 iQue^® 세포 확산 및 라벨링(V/Blue) 염료로 라벨링하여 각 웰에서 구별할 수 있도록 했습니다(그래프 참조).

(A,B) 항CD20 mAb(리툭시맙, 트룩시마, 비치료용 항CD20)의 경우, 항원에 양성인 세포에 특이적으로 CDC가 증가했습니다. (C,D) 항Her2 항체(트라스투주맙, 카드실라, 페르투주맙)는 모두 CDC에 영향을 미치지 않았습니다. (E,F) 부착세포에 대해서는 CDC 작용이 관찰되지 않았습니다. 이는 CD46, CD55, CD59 등 부착세포에 대한 보체 조절 표지자의 발현 증가 때문일 가능성이 높습니다.
 

그림 5. 새로운 데이터 시각화 기능이 탑재된 iQue^® Forecyt 소프트웨어를 사용한 혈청 공여자 간 CDC 작용 비교

4개의 서로 다른 인간 혈청 공여자에 대해 리툭시맙에 의한 CDC 유도를 비교했습니다. 공여자 1~3의 CDC는 EC₅₀ 값이 0.29~0.36µg/mL로 유사했습니다. 공여자 4 혈청의 CDC는 리툭시맙에 대해 측정된 EC₅₀ 값이 0.53µg/mL로 소폭 낮았습니다.