림프구 혼합배양반응(MLR)
면역관문은 T세포를 켜고 끄는 스위치 역할을 하는 조절 신호입니다. T세포가 종양세포나 가지세포(DC)와 같은 항원제시세포(APC)와 결합하면 관문이 활성화됩니다. 관문억제제라고 하는 면역치료제는 바로 이 T세포와 APC 사이의 시냅스를 표적으로 하여 일반적으로 T세포를 ‘끄는’ 면역관문을 차단할 수 있도록 개발되었습니다. 이 방법은 T세포를 한층 더 활성화시키고 항암 반응을 높여줍니다. 현재 암 치료용으로 허가된 관문억제제에는 항PD-1, 항PD-L1, 항CTLA4 단일클론항체 등이 있으며, 개발 중인 제품도 많습니다.
MLR은 두 명의 면역세포를 혼합배양해 면역관문 조절에 필요한 ‘비자기’ 인식을 촉발하는 시험관 내 분석법입니다. 이 분석은 T세포 반응 강화 능력을 평가해 치료제 후보를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. MLR을 통한 기존의 T세포 반응 측정 기술에는 흔히 다음과 같은 단점이 있습니다.
- 사이토카인(ELISA 등), 확산, 표지자 발현(기존 유세포분석 등)을 별도로 분석해야 합니다.
- 획득 처리량이 낮은 장비를 사용해 대량의 샘플이 필요합니다.
- 플레이트 판독기와 ELISA 등, 여러 출처에서 취합한 데이터를 직접 분석해야 합니다.
- 프로토콜 최적화, 고정, 반복적인 세척 등 필요한 단계가 많아 번거롭고 시간이 오래 걸립니다.
싸토리우스의 iQue® 고성능 고처리량 유세포분석기와 검증된 관련 시약 세트를 사용하면 한결 간편하고 확실하게 MLR을 통한 T세포 반응을 측정할 수 있습니다. iQue® 인간 T세포 활성화 키트와 iQue Qbeads® 인간 염증 패널 키트 등, 여러 개의 iQue® 키트를 결합해 원하는 대로 다양한 결과를 도출할 수도 있습니다. iQue®와 자동 통합 분석 기술을 활용해 새로운 면역치료제의 T세포 반응 활성화 효과에 대한 약리학적 분석 결과를 즉시 확인하세요.
적용분야
분석 개요
그림 1. 림프구 혼합배양반응(MLR) 분석 원리
단방향 MLR의 경우, 한 공여자의 분리된 CD4 양성 T세포를 다른 공여자의 DC와 혼합하여 단방향 T세포 활성화를 유도합니다. 양방향 MLR의 경우, 두 공여자의 PBMC를 혼합배양해 두 공여자의 T세포를 양방향 활성화합니다. 두 분석 모두 ‘비자기’로 인식되는 DC의 MHC 분자에 대한 동종이형 반응에 따라 T세포 활성화가 일어납니다. 이 반응은 공여자의 HLA 일배체형 차이를 바탕으로 합니다. 항PD-1, 항CTLA4 단일클론항체 등 관문억제 약물을 첨가하면 동종이형 MHC에 의한 T세포 활성화 반응을 더 잘 유도할 수 있습니다. 단방향 또는 양방향 MLR을 통한 T세포 반응은 iQue® 3와 iQue® 인간 T세포 활성화 키트, iQue Qbeads® 인간 염증 패널 키트, 커스텀 iQue Qbeads® PlexScreen 키트 등 다양한 관련 키트를 사용해 분석할 수 있습니다. 키트는 단독으로 사용할 수도 있고, 필요에 따라 다른 키트와 조합하여 하나의 분석 플레이트로 확산, 표지자 발현, 사이토카인 분비를 측정할 수도 있습니다.
주요 장점
표면 표지자 & 사이토카인 발현 동시 정량 - 하나의 웰로 면역표현형과 작동 사이토카인 농도를 Multiplex 분석합니다.
정량적 데이터 확보 - 약리학적 분석에 적합한 T세포 반응 측정 결과를 제공합니다.
고처리량 분석 수행 - 96웰 또는 384웰 플레이트로 표지자와 사이토카인을 신속하게 정량화해 스크리닝 및 프로파일링 연구 속도를 높일 수 있습니다
생산성 최대화 - 실시간 데이터 분석 및 새로운 시각화 툴을 통해 빠른 시간 안에 답을 얻어낼 수 있습니다.
표면 표지자 & 사이토카인 발현 동시 정량
하나의 웰로 면역표현형과 작동 사이토카인 농도를 Multiplex 분석
그림 2. 관문억제제로 유도한 사이토카인 분비 및 표지자 발현을 하나의 웰로 측정
하룻밤 동안 DC를 해동하고 활성화(IL-4, 그랜자임 B 및 LPS 사용)한 다음, 96웰 플레이트에 웰당 40K씩 플레이팅했습니다. 그리고 B/Green 라벨링 염료로 라벨링한 CD4 양성 T세포를 첨가했습니다(T세포:DC = 3:1). 이후 여러 농도의 관문억제제 펨브롤리주맙(항PD-1 단일클론항체)을 첨가해 T세포 활성화를 향상시켰습니다. 사이토카인 샘플은 2일 차와 6일 차에, 표지자 발현은 분석 엔드포인트(6일 차)에 분석했습니다. iQue® 인간 T세포 활성화 키트와 iQue® 3 플랫폼을 사용해 샘플의 (A) IFNγ 분비, (B) TNFa 분비, (C) CD25 발현을 분석했습니다.
정량적 데이터 확보
약리학적 분석에 적합한 T세포 반응 측정 결과 제공
그림 3. iQue Forecyt®의 자동 EC50 계산 기능으로 약물 유도 T세포 반응 정량화
DC(40K/웰)와 라벨링한 CD4 양성 T세포를 함께 시딩(T세포:DC = 3:1)하고 펨브롤리주맙으로 처리했습니다. 10uL의 샘플을 2일 차와 6일 차에 iQue Qbeads® 인간 염증 패널 키트를 사용해 분석했습니다. (A) 웰당 IL-2(pg/mL) 분비를 나타낸 히트 맵입니다. 대조군 웰에는 약물 없이 T세포와 DC만 포함시켰습니다. (B-E) 펨브롤리주맙 농도와 시간에 따른 염증 사이토카인 분비 곡선입니다. 펨브롤리주맙에 대한 반응으로 분비된 IL-2의 2일 차 EC50는 0.53ug/mL이었지만, 6일 차에는 모든 IL-2 생성이 중단되었습니다. IL-6, CCL2, CCL3 수준은 2일 차부터 6일 차까지 모두 증가했습니다. 6일 차의 CCL2 및 CCL3 분비에 대한 EC50 값은 각각 0.98ug/mL과 1.0ug/mL으로 매우 유사했습니다.
고처리량 분석 수행
96웰 또는 384웰 플레이트로 표지자와 사이토카인을 신속하게 정량화해 스크리닝 및 프로파일링 연구 속도 향상
그림 4. 384웰 분석 포맷을 사용해 여러 PBMC 공여자 쌍에 걸쳐 관문억제제가 사이토카인 분비에 미치는 영향을 신속하게 프로파일링
여러 공여자에게서 채취한 PBMC(80K/웰)를 단독으로(단일 공여자 대조군) 또는 함께(총 공여자 8쌍) 시딩했습니다. 그리고 세포를 다양한 농도의 항CTLA4 관문억제 항체로 처리했습니다. PHA 및 MMC를 혼합한 PBMC도 각각 양성 및 음성 대조군으로 포함시켰습니다. 3일 뒤, IFNγ iQue Qbeads®와 검량선으로 계산한 농도를 사용해 샘플의 사이토카인 농도를 분석했습니다. (A) PBMC 공여자 쌍 간의 항CTLA4로 유도된 IFNγ 분비 차이를 나타낸 히트 맵입니다. (B) 막대 그래프를 통해 단일 공여자 대조군과 비교해 혼합 PBMC의 IFNγ 분비량이 일관적으로 더 많다는 점을 확인할 수 있습니다. 17ng/mL의 항CTLA4를 첨가해 강화된 반응입니다. (C) 항CTLA4에 대한 공여자 쌍 7의 반응을 나타낸 대표 농도반응곡선입니다(EC50 = 6.5ng/mL).
생산성 최대화
실시간 데이터 분석 및 새로운 시각화 툴을 통해 빠른 시간 안에 결과 도출
그림 5. iQue Forecyt®의 프리셋 게이팅 및 자동 데이터 분석 기능으로 즉시 T세포 활성화 결과 판독 가능
2명의 공여자에게서 채취한 CD4 양성 T세포를 각각 공여자 1명의 DC와 다양한 비율로 혼합배양했습니다. 각 T세포 공여자와 DC 공여자의 대립유전자 불일치 정도는 서로 달랐습니다. 공여자 1의 T세포는 DC 공여자와 HLA 프로파일이 비교적 비슷해 불일치 대립유전자가 8개 중 3개뿐이었고(2 x HLA-A, -B, -C, -DR 대립유전자), 공여자 2의 T세포는 대립유전자 8개 중 7개가 불일치했습니다. T세포만 배양한 음성 대조군과 Dynabeads 또는 Immunocult를 함께 배양한 양성 대조군도 포함시켰습니다. 분석은 iQue® 인간 T세포 활성화 키트로 수행했습니다. (A) 웰별로 CD4 양성 군집 내 CD25 발현 차이를 보여주는 플레이트 뷰입니다. T:DC 비율이 감소하면 T세포 활성도가 증가했고, 공여자 2의 T세포 활성도가 더 높았습니다. HLA 대립유전자 불일치도가 높으면 ‘비자기’ 세포 인식이 촉진되므로 예상할 수 있는 결과입니다. (B)와 (C)는 공여자 1과 공여자 2의 CD25 양성 T세포 비율을 나타냅니다(T:DC = 3:1). (D) CD4 양성 군집 중 CD25 세포의 비율을 정량화한 막대 그래프입니다.
MLR 분석과정
그림 6. iQue® 3을 사용한 단방향 및 양방향 MLR 분석과정
필요에 따라 다양한 세포 및 비드 기반 키트를 선택해 분석 변수를 정의할 수 있습니다. 이 분석은 iQue® 인간 T세포 활성화 키트, iQue Qbeads® 인간 염증 패널 키트, 커스텀 iQue Qbeads® PlexScreen 키트를 사용해 검증되었습니다.
주문 정보
iQue® 인간 T세포 활성화 키트 | ||
|---|---|---|
플랫폼: iQue® 3/iQue® Screener Plus - VBR Configuration과 호환 | ||
| 크기 | 카탈로그 번호 | |
1 x 96웰 | 90560 | |
5 x 96웰 | 90561 | |
1 x 384웰 | 90562 | |
5 x 384웰 | 90563 | |
| iQue Qbeads® 인간 염증 패널 키트 | ||
|---|---|---|
플랫폼: iQue® 3/iQue® Screener– BR 및 VBR Configurations와 호환 | ||
| 크기 | 카탈로그 번호 | |
1 x 384웰 | 97097 | |
5 x 384웰 | 97098 | |
| iQue Qbeads® PlexScreen: 인간 분비 단백질 | ||||
|---|---|---|---|---|
사이토카인 | ||||
| 케모카인 | TNF | 인터루킨 | ||
| CCL2 (MCP-1) | TNF (TNFα) | IL-1α | IL-10 | |
| CCL3 (MIP-1α) | sCD154 (sCD40 리간드) | IL-1β | IL-11 | |
| CCL5 (RANTES) | CD178 (Fas 리간드) | IL-2 | IL-12/IL-23 (p40) | |
| CCL11 (에오탁신) | TNFβ (LT-α/TNFSF1) | IL-3 | IL-12 (p70) | |
CD14 | IL-4 | IL-13 | ||
CXCL9 (MIG) | IL-5 | IL-17A | ||
CXCL10 (IP-10) | IL-6 | IL-17F | ||
CXCL11 (I-TAC) | IL-7 | IL-21 | ||
CX3CL1 (프랙탈카인) | IL-8 | IFN-α | ||
IL-9 | IFN-γ | |||
수용체 | 부착 분자 | 성장인자 | 효소 | |
CD121a (IL-1 RI) | CD54 (ICAM-1) | 안지오제닌 | 그랜자임 A | |
CD121b (IL-1 RII) | CD62E (E-셀렉틴) | 기본 FGF | 그랜자임 B | |
TNFRI | CD62L (L-셀렉틴) | CSF2 (GM-CSF) | ||
TNFRII | CD62P (P-셀렉틴) | CSF3 (G-CSF) | ||
CD106 (VCAM-1) | VEGF | |||
