바이오 의학 및 의약품 연구를 위한 줄기세포 콜로니 및 콜로니 일부 정밀 분리

• 새로 유래된 iPS 콜로니의 클론 채취
• 유전체 편집(CRISPR) 후 콜로니 채취
• 2~3개의 도착 플레이트로 옮길 콜로니 분할(복제 플레이트 제작)
• 분화된 줄기세포 콜로니 분리
• 메틸셀룰로오스에서 조혈줄기세포 콜로니 스캔 및 분석
• 단일 줄기세포 분리(단일 세포 클로닝 또는 이질성 연구)
• 분화된 영역을 제거하여 줄기세포 배양액 청소

iPS 콜로니 자동 분리: 개요 이미지는 해당하는 웰의 전체 스캔(왼쪽)을 보여주고, 채취 전후 이미지는 채취 과정을 기록해줍니다(중간 및 오른쪽).

CellCelector는 부착성 콜로니 채취를 위해 매우 정교한 십자형 스크레이프 기능과 동시 콜로니 흡입 기술을 함께 사용합니다. 따라서 배양 플레이트 바닥이나 영양세포층에서 부드럽게 콜로니를 떼어낼 수 있습니다.

여기서는 프로피듐 요오드화물(PI) 염색을 통해 수동으로 세포 생존 여부를 평가하고, 새로운 플레이트로 옮긴 뒤 hESC 콜로니를 자동 채취했습니다.

이미지를 보면 수동 채취 시보다 자동 분리를 사용했을 때 사멸세포의 수가 더 적은 것을 알 수 있습니다.

hESCs 위상대조 이미지는 해당하는 PI 염색 형광 이미지와 병합한 것입니다(척도 50µm).

왼쪽: 수동 채취 콜로니, 오른쪽: 이동 후 자동 채취 콜로니.

콜로니 형태 또한 현재 콜로니 상태에 대해 중요한 정보를 제공합니다. 대표 콜로니의 위상대조 이미지는 새로운 배양 접시로 자동 패시징을 수행하고 3일 뒤(왼쪽)와 5일 뒤(오른쪽)에 촬영한 것입니다. 콜로니에서는 정상적인 성장이 나타났습니다. 이는 CellCelector로 자동 채취한 줄기세포 콜로니와 같은 패시지로 수동 채취한 콜로니 사이에 유의미한 차이가 없음을 보여줍니다. 성장 행동 역시 유사했습니다.

새로운 배양 접시로 자동 패시징을 수행한 후 대표 콜로니의 위상대조 이미지

왼쪽: 패시징 3일 후, 오른쪽: 패시징 5일 후

CellCelector 채취 과정에 대한 줄기세포의 다분화능 상태 관련 반응을 알아보기 위해 hESC 콜로니를 다분화능 관련 표지자 Oct4, SSEA-1, Tra-1-60, Nanog로 염색했습니다.

일반적인 표지자에 대한 면역세포화학적 발현 분석은 세포 이동의 영향을 규명할 수 있는 신뢰성 높은 방법입니다. CellCelector의 이미징 소프트웨어를 통해 다분화능 유지나 세포 운명 결정에 있어 중요한 역할을 하는 특정 단백질을 형광 라벨링 항체로 시각화하고 쉽게 검출할 수 있습니다.

이 실험에서는 hESC 콜로니의 다분화능을 확인할 수 있었습니다. 발현 수준은 기존 방식으로 증식시킨 hESC와 비슷했습니다.

(B)는 다분화능 관련 표면 표지자인 Tra-1-60, (C)와 (D)는 각각 다분화능 인자 Oct4와 Nanog, (E)는 분화된 인간 세포의 표면 표지자인 SSEA-1의 면역세포화학적 염색을 나타냅니다. 일차 항체는 Alexa-555와 결합한 이차 항체를 사용해 시각화했습니다. 세포 핵은 Hoechst 또는 DAPI로 대조염색했습니다.

(F) 다분화능 관련 표지자 Tra-1-60과 분화 표지자 SSEA-1을 발현하는 세포는 FACS 분석으로 정량화했습니다.

미분화 줄기세포를 영양세포(주로 섬유모세포)와 혼합배양하여 줄기세포의 안정성 및 생존성을 유지해주는 환경을 조성할 때 흔히 사용되는 방법입니다.

그러나 영양세포 이동 없이 줄기세포를 분리하려면 정교한 기술이 필요합니다. CellCelector를 사용하면 영양세포에서 줄기세포 콜로니를 자동 이동시킬 수 있습니다.

영양세포 위의 인간 배아줄기세포(hESC)