세포계측법을 이용한 고처리량 스크리닝(HTS)을 통한 단클론 항체 결합 분석

그림 1a. iQue^® HTS 플랫폼을 사용하여 시험 항체(mAb)와 생세포의 결합을 평가하는 간단한 워크플로우

그림 1b. iQue^® 경쟁적 결합 분석 워크플로우

경쟁 항체는 형광 표지된 이차 항체와 함께 튜브에서 미리 표지된 후, 분석 플레이트에서 표지되지 않은 시험 항체와 결합됩니다. 그런 다음 표적 세포를 이 항체 혼합물에 첨가하면, 표지된 경쟁 항체와 시험 항체는 동일한 에피토프를 표적으로 하는 경우 표적 항원에 대한 결합을 위해 경쟁합니다. 따라서 시험 항원의 농도가 높을수록 표지된 경쟁 항체의 결합량이 줄어들어 이차 항체 형광 표지자의 평균 형광 강도(MFI) 값이 낮아집니다. 두 항체가 동일한 에피토프를 표적으로 하지 않는 경우, MFI 값은 시험 항체 농도의 영향을 받지 않습니다.

복잡한 데이터를 더 빠르게 수집하고 분석하여 더 신속한 의사 결정을 내리세요.

그림 2. iQue Forecyt^® 소프트웨어의 새로운 데이터 시각화 기능을 사용하여 항-CD20 바이오시밀러의 결합을 비교한 결과

CD20 발현이 높은 Raji 세포에 대한 항-CD20 단클론항체 리툭시맙(Rituximab)과 그 바이오시밀러 중 하나인 트룩시마(Truxima)의 결합을 측정하기 위해 직접 단클론항체 결합 분석법을 사용하였다. (A) 게이트 임계값 이상에서 항체 결합 양성 반응을 보이는 생세포의 비율을 나타낸 히트맵. (B) 히스토그램은 2차 항체의 평균 형광 강도(MFI)가 리툭시맙과 트룩시마의 농도에 따라 증가하지만, IgG 대조군에서는 증가하지 않음을 보여준다. (C) 농도-반응 곡선은 게이트 임계값 이상에서 단클론항체 결합 양성 반응을 보이는 세포의 비율을 나타낸다. (D) iQue Forecyt^®에서 직접 내보낸 값 표는 (C)의 곡선에 대한 적합 특성을 자세히 보여준다.

고처리량 항체 발굴 워크플로우의 일환으로 최소한의 시간 내에 세포 표면 결합에 대한 항체 라이브러리 스크리닝을 수행합니다.

그림 3. 에피토프 결합의 차이를 밝히기 위해 경쟁 결합 분석 형식을 사용하여 항체를 선별합니다.

세 가지 항HER2 치료용 단클론항체(트라스투주맙, 카드시라, 페르투주맙)에 RPE 접합 이차 항체를 1:1 비율로 표지하고(1.5 µg/mL), iQue^® 세포막 무결성(R/Red) 염료 및 다양한 농도의 비표지 단클론항체와 함께 384웰 플레이트에 첨가하였다. HER2 발현이 높은 AU565 세포를 첨가하고 플레이트를 얼음 위에서 45분간 배양한 후, iQue^® HTS 플랫폼을 사용하여 데이터를 수집하였다.

히트맵은 생세포에서 이차 항체의 평균 형광 강도(MFI)를 보여줍니다(진한 회색 = 높은 MFI; 밝은 회색 = 낮은 MFI). 데이터에 따르면 트라스투주맙과 카디클라(트라스투주맙 기반 ADC)는 동일한 HER2 에피토프에 대한 결합 경쟁이 존재합니다. 페르투주맙은 다른 HER2 에피토프에 결합하며 다른 단클론항체와는 경쟁하지 않습니다. 트라스투주맙을 가열하면 가열하지 않은 항체에 비해 다른 단클론항체와의 경쟁 정도가 약간 감소합니다.

부유 세포 모델 또는 부착 세포 모델에서 여러 치료용 항체의 특성을 분석합니다.

그림 4. 부유 세포와 부착 세포 모두에서 표적 항원에 대한 항체 결합의 특이성을 평가합니다.

두 가지 치료용 항체인 리툭시맙과 트라스투주맙의 결합 및 특이성을 부유 및 부착성 암세포주 모델을 사용하여 평가했습니다. CD20 양성 라모스 세포와 HER2 양성 AU565 세포는 항원 음성인 주르캇 세포 및 MDA-MB-468 세포와 구별하기 위해 iQue^® 세포 증식 및 인코딩 염료(V/Blue)로 표지했습니다.

RPE 접합 이차 항체 결합으로 인한 MFI는 항원 양성 세포에 대한 mAb 결합이 농도 의존적으로 증가하는 것을 보여주었으며, 항원 음성 세포에 대한 결합은 IgG 대조군과 유사했습니다.

단일 배양웰에서 함께 배양된 서로 다른 세포 유형에 대한 항체 결합을 동시에 평가하여 샘플을 최대한 활용하십시오.

그림 5. 단일 웰에서 다양한 항원 발현 세포 유형에 대한 항체 결합을 분석합니다.

(A) 세 가지 부착성 세포주(AU565, MCF7 및 BT474)에서 HER2 발현을 접합된 항-HER2 항체를 사용하여 분석하고 HER2 음성인 Ramos 세포의 발현과 비교했습니다. 상대적 HER2 발현: AU565 > BT474 > MCF7. (B) 항체 결합 분석에서 세포를 구분하기 위해 AU565 세포에는 고농도의 iQue^® 세포 증식 및 인코딩 염료(V/Blue)를, MCF7 세포에는 저농도의 염료를, BT474 세포에는 염료를 처리하지 않았습니다. (C) 세 가지 세포주에 대한 트라스투주맙 결합은 각 세포주의 상대적 HER2 발현 수준을 반영했습니다(AU565 > BT474 > MCF7). (D) 트라스투주맙 결합에 대한 EC50 값은 세 가지 세포 유형에서 유사했습니다(±95% 신뢰 구간).