세포 분석을 통한 고처리량 스크리닝(HTS)을 이용한 단클론 항체 결합 분석

그림 1a. iQue^® HTS 플랫폼을 사용하여 생세포에 대한 테스트 단클론항체의 결합을 평가하는 간단한 워크플로우

Figure 1b. iQue^® 경쟁적 결합 분석 워크플로우

경쟁 항체는 분석 플레이트에서 관심 있는 비표지 검사 항체와 결합하기 전에 형광 표지된 이차 항체와 함께 튜브에 사전 표지됩니다. 그런 다음 대상 세포를 이 항체 혼합물에 추가하고, 표지된 경쟁 단클론항체와 검사 단클론항체는 동일한 에피토프를 대상으로 하는 경우 대상 항원 결합을 위해 경쟁하게 됩니다. 따라서 검사 항원의 농도가 높을수록 표지된 경쟁 항체의 결합은 줄어들어 이차 항체 형광의 MFI 값이 낮아집니다. 두 항체가 동일한 에피토프에 대해 경쟁하지 않는 경우, MFI는 검사 단클론항체 농도의 영향을 받지 않아야 합니다.

복잡한 데이터를 더 빠르게 수집하고 분석하여 신속한 의사결정을 내리세요.

그림 2. iQue Forecyt^® 소프트웨어의 새로운 데이터 시각화 기능을 사용하여 항-CD20 바이오시밀러의 결합 비교

직접 단클론항체 결합 분석을 통해 고 CD20 발현 Raji 세포에 대한 항-CD20 단클론항체 Rituximab과 그 바이오시밀러인 Truxima의 결합을 측정했습니다. (A) 게이트된 임계값 이상으로 항체 결합이 양성인 생존 세포의 비율에 대한 열 지도. (B) 히스토그램은 이차 항체의 평균 형광 강도(MFI)가 IgG 대조군이 아니라 Rituximab과 Truxima 농도와 함께 증가함을 보여줍니다. (C) 농도-반응 곡선은 게이트된 임계값 이상의 단클론항체 결합에 대해 양성인 세포의 비율을 나타냅니다. (D) iQue Forecyt^®에서 직접 내보낸 값 테이블은 (C)의 곡선 적합 특성을 자세히 설명합니다.

항체의 세포 표면 결합을 고처리량 항체 발견 워크플로의 일부로 최소 시간에 스크리닝합니다.

그림 3. 상피 에피토프 결합의 차이를 밝히기 위해 경쟁 결합 분석 형식을 사용하여 항체 스크리닝

HER2에 대한 세 가지 치료용 단클론 항체(트라스투주맙, 카드실라 및 퍼투주맙)를 RPE 접합 이차 항체(1:1 표지 비율, 1.5 µg/mL)로 표지하고 iQue^® 세포막 무결성(R/Red) 염료 및 다양한 농도의 비표지 단클론 항체와 함께 384 웰 플레이트에 추가했습니다. 높은 HER2를 발현하는 AU565 세포를 추가하고 플레이트를 얼음 위에서 45분간 배양한 후 iQue^® HTS 플랫폼을 사용하여 데이터를 수집했습니다.

열 지도는 생존 세포의 이차 항체에 대한 중간 형광 강도(MFI)를 보여줍니다(진한 회색 = 높은 MFI; 연한 회색 = 낮은 MFI). 데이터는 트라스투주맙과 카드실라(트라스투주맙 기반 ADC) 사이에 동일한 HER2 에피토프에 대한 경쟁이 있음을 보여줍니다. 퍼투주맙은 다른 HER2 에피토프에 결합하며 다른 단클론 항체와 경쟁하지 않았습니다. 트라스투주맙을 가열하면 가열되지 않은 단클론 항체와 비교하여 다른 단클론 항체와의 경쟁 정도가 약간 감소했습니다.

부유 또는 부착 세포 모델에서 다양한 치료용 항체 특성 분석

그림 4. 부유 및 부착 세포 모두에서 대상 항원에 대한 항체 결합 특이성 평가

두 가지 치료용 항체인 리투시맙과 트라스투주맙의 결합력과 특이성을 부착성 및 부유성 암세포 모델을 사용하여 평가했습니다. CD20 양성 라모스 세포와 HER2 양성 AU565 세포를 항원 음성 주카트 및 MDA-MB-468 세포와 구분하기 위해 iQue^® 세포 증식 및 인코딩 염료(V/블루)로 표지했습니다.

RPE-결합 이차 항체 결합으로 인한 MFI는 항원 양성 세포에서 mAb 결합의 농도 의존적 증가를 보였으며, 항원 음성 세포의 결합은 IgG 대조군과 비교할 수 있었습니다.

고유의 샘플을 최대한 활용하여 단일 웰에서 공동 배양된 서로 다른 세포 유형에 대한 항체 결합을 동시에 평가하세요.

그림 5. 단일 웰에서 다양한 항원 발현 세포 유형에 대한 항체 결합 분석

(A) HER2 음성 Ramos 세포와 비교하여 세 가지 부착성 세포주(AU565, MCF7 및 BT474)의 HER2 발현을 결합된 항-HER2 항체를 사용하여 분석했습니다. 상대적 HER2 발현: AU565 > BT474 > MCF7. (B) 항체 결합 분석에서 세포를 구분하기 위해 AU565 세포는 고농도의 iQue^® 세포 증식 및 인코딩 염료(V/Blue)로 표지했고, MCF7 세포는 낮은 농도로 표지했으며, BT474 세포는 표지하지 않았습니다. (C) Trastuzumab의 세 세포주에 대한 결합은 그들의 상대적인 HER2 발현 수준을 반영했습니다(AU565 > BT474 > MCF7). (D) Trastuzumab 결합의 EC50 값은 세 가지 세포 유형에서 비교 가능했습니다(±95% 신뢰 구간).