실시간 생세포 분석을 통한 대식세포 기능 이해

불멸화된 THP-1 세포와 혈액 유래 일차 단핵구의 분화 과정 중 형태학적 변화 모니터링. THP-1 세포는 48시간 동안 5 ng/mL PMA에 노출시켜 M0 대식세포로 분화되었습니다. 일차 단핵구는 6일 동안 50 ng/mL GM-CSF에서 배양한 후 1일 더 1 ng/mL LPS + 20 ng/mL IFN-γ를 처리하여 M1 유사 표현형으로, 또는 6일 동안 50 ng/mL M-CSF에서 배양한 후 1일 더 20 ng/mL IL-4를 처리하여 M2 유사 표현형으로 분화되었습니다. 형태는 이전 연구 결과(Young 등, J Immunol, 1990)와 일치하며, M1 집단은 계란 프라이 모양을, M2는 계란 프라이 및 방추형 세포의 혼합 집단을 보입니다.

형태 이미지는 큰 소포를 포함하는 종말 분화된 인간 유도만능줄기세포 유래 대식세포를 생성하는 분화하는 인간 유도만능줄기세포 유래 단핵구의 형태학을 보여줍니다 (0-7일). 분화는 최소 7일 동안 유지 배지에 100 ng/mL M-CSF를 추가하여 달성되었습니다.

THP-1 단핵구는 (미분화) 배지, 비타민 D3 또는 PMA에 노출되었으며, Incucyte^® Fabfluor-488 항체 복합체와 함께 CD11b, CD14 또는 CD40에 노출되었습니다. PMA는 배지 단독 또는 비타민 D3 처리된 세포와 비교하여 세포 형태에 현저한 변화(HD-위상차 대비 이미지)를 보였습니다. 동역학 그래프는 다양한 처리에 대한 차등적이고 시간 의존적인 표면 단백질 발현을 강조합니다.

THP-1 세포를 나이브 또는 PMA로 분화된 M0 상태로 피브로넥틴이 코팅된 ClearView 주화성 멤브레인에 시딩했습니다. 세포는 C5a 농도 구배에 노출되었으며, Incucyte 시스템을 사용하여 매시간 이미지를 획득했습니다. 약리학적 반응 분석은 t=30시간에 수행되었습니다. 분화된 대식세포 유사 THP-1 세포는 C5a에 대해 강한 농도 의존적 반응을 보였지만, 분화 이전의 THP-1 세포에서는 거의 또는 전혀 반응이 관찰되지 않았습니다.

원발 혈액 단핵구를 M2와 유사한 표현형으로 분화시킴; 6일 동안 50 ng/mL M-CSF, 이후 1일 더 20 ng/mL IL-4 처리. 대식세포를 마트리젤로 코팅된 ClearView 주화성 막에 파종하고, C5a 농도 구배에 노출시킨 후 Incucyte 시스템을 사용하여 2시간마다 이미지 획득. 하부면 위상 분석을 수행하고 4.5 및 11시간에 약리학적 반응 결정. 고농도에서 응답 지연으로 인한 상당한 시간 의존적 C5a 효능 변화 확인, 이는 호중구 사용 시 관찰되지 않은 특정 반응.

iPSC 유래 대식세포(Axol Bioscience)가 시간과 세포 수에 따라 Incucyte^® pHrodo^® 녹색 대장균 바이오입자^®를 섭취합니다. 100 ug/well의 pHrodo^® 녹색 대장균 바이오입자^® 존재 하에 iPSC 유래 대식세포의 위상차 및 형광 혼합 이미지는 바이오입자^®의 섭취를 보여줍니다. 각 이미지 아래에는 파골작용 동역학을 완전히 정량화하기 위한 분할을 강조하는 마스크 이미지가 있습니다. 단일 pHrodo^® 녹색 대장균 바이오입자 양(100 ug/well)을 사용한 iPSC 유래 대식세포의 파골작용 시간 경과는 세포 수 의존성을 보여줍니다.

CD47 항체(B6H12.2)의 농도를 점진적으로 증가시켜 처리된 CCRF-CEM 세포를 인간 골수 유래 대식세포(BMDM)에 추가한 결과 (값은 평균 ± 표준오차, n=4).

J774.A1 대식세포 내부의 포식된 Jurkat 세포는 세포 포식의 양에 비례하는 높은 형광 강도를 보입니다. 빠른 이미징과 2분 간격을 사용하여 개별 포식 사건을 보여주는 동영상을 만들 수 있습니다.

THP-1 세포를 200 nM PMA에 24시간 노출하여 M0, M1 또는 M2 대식세포로 분화시켰으며, 각각 200 nM PMA 24시간, 200 nM PMA 24시간 + 20 ng/mL IFNγ + 1 µg/mL LPS, 또는 200 nM PMA 24시간 + 20 ng/mL IL-4 조건으로 처리했습니다. 세포들은 pHrodo 빨간색으로 표지된 사멸성 Jurkat 세포와 공동 배양되었으며, 분화된 대식세포의 탐식 능력은 섭취된 Jurkat 세포의 형광 신호로 평가되었습니다. 데이터는 M0와 M2로 분화된 THP-1 세포 모두 유의미하게 높은 탐식 능력을 가지고 있음을 보여주며, 이는 M2 대식세포의 항염증 기능과 일치합니다.