대식세포 기능의 실시간 생세포 분석 이해

불멸화된 THP-1 세포와 혈액 유래 단핵구의 분화 중 형태학적 변화 모니터링. THP-1 세포는 48시간 동안 5 ng/mL PMA에 노출시켜 M0 대식세포로 분화되었습니다. 단핵구는 6일 동안 50 ng/mL GM-CSF에서 배양한 후 1 ng/mL LPS + 20 ng/mL IFN-γ를 하루 더 처리하여 M1 유사 표현형으로, 또는 6일 동안 50 ng/mL M-CSF에서 배양한 후 20 ng/mL IL-4를 하루 더 처리하여 M2 유사 표현형으로 분화되었습니다. 형태는 이전 연구 결과(Young 등, J Immunol, 1990)와 일치하며, M1 집단은 계란말이 모양을, M2는 계란말이와 방추형 세포의 혼합 집단을 보입니다.

위상차 현미경 이미지는 큰 소포를 포함하는 최종 분화된 인간 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 대식세포로 분화되는 인간 iPSC 유래 단핵구의 형태학적 변화를 보여줍니다 (0-7일). 분화는 최소 7일 동안 유지 배지에 100 ng/mL M-CSF를 첨가하여 달성되었습니다.

THP-1 단핵구를 배지(미분화), 비타민 D3 또는 PMA에 노출시켰으며, Incucyte^® Fabfluor-488 항체 복합체를 CD11b, CD14 또는 CD40와 함께 사용했습니다. PMA는 배지 단독 또는 비타민 D3로 처리된 세포와 비교하여 세포 형태에서 현저한 변화를 보였습니다(HD-위상차 이미지). 동역학 그래프는 다양한 처리에 대한 반응으로 차등적이고 시간 의존적인 표면 단백질 발현을 강조합니다.

THP-1 세포를 순수한 상태 또는 PMA로 분화된 M0 상태로 피브로넥틴이 코팅된 ClearView 주화성 멤브레인에 배양했습니다. 세포들은 C5a 농도 구배에 노출되었으며, Incucyte 시스템을 사용하여 매 시간 이미지를 획득했습니다. 약리학적 반응 분석은 30시간 시점에서 수행되었습니다. 분화된 대식세포 유사 THP-1 세포는 C5a에 대해 강한 농도 의존적 반응을 보였지만, 분화 이전의 THP-1 세포에서는 거의 또는 전혀 반응이 관찰되지 않았습니다.

원발성 단핵구를 M2 유사 표현형으로 분화시켰습니다. 6일 동안 50 ng/mL M-CSF를 처리한 후, 추가로 1일 동안 20 ng/mL IL-4를 처리했습니다. 대식세포를 마트리젤로 코팅된 ClearView 주화성 막에 파종하고, C5a 농도 구배에 노출시킨 후 Incucyte 시스템을 사용하여 2시간마다 이미지를 획득했습니다. 하부 위상 분석을 수행하고 4.5시간과 11시간에 약리학적 반응을 결정했습니다. 고농도에서 응답 지연으로 인한 시간 의존적 C5a 효능 변화를 주목할 만하며, 이는 호중구를 사용했을 때는 관찰되지 않은 특정 반응입니다.

역분화 줄기세포 유래 대식세포(Axol Bioscience)가 시간과 세포 수에 따라 Incucyte^® pHrodo^® 녹색 대장균 바이오입자^®를 탐식합니다. 100 ug/well의 pHrodo^® 녹색 대장균 바이오입자^®가 있는 역분화 줄기세포 유래 대식세포의 위상차 및 형광 혼합 이미지는 바이오입자^®의 섭취를 보여줍니다. 각 이미지 아래에는 대식세포의 탐식 동역학을 완전히 정량화하는 분할을 강조하는 마스크 이미지가 있습니다. 단일 pHrodo^® 녹색 대장균 바이오입자 양(100 ug/well)을 사용한 역분화 줄기세포 유래 대식세포의 탐식 시간 경과는 세포 수 의존성을 보여줍니다.

증가하는 농도의 항-CD47 항체(B6H12.2)로 처리된 CCRF-CEM 세포를 인간 골수 유래 대식세포(BMDM)에 추가한 결과 (표시된 값은 평균 ± 표준오차, n=4).

J774.A1 대식세포 내부의 포획된 Jurkat 세포는 세포 식균 작용의 양에 비례하는 높은 형광 강도를 보입니다. 신속한 이미징과 2분 간격을 사용하여 개별 포획 사건을 보여주는 동영상을 만들 수 있습니다.

THP-1 세포를 200 nM PMA에 24시간 노출하여 M0, M1 또는 M2 대식세포로 분화시켰습니다. 각각 200 nM PMA 24시간, 200 nM PMA 24시간 + 20 ng/mL IFNγ + 1 µg/mL LPS, 또는 200 nM PMA 24시간 + 20 ng/mL IL-4로 처리했습니다. 세포를 pHrodo 레드로 표지된 사멸 Jurkat 세포와 공동 배양한 후, 분화된 대식세포의 식세포 능력을 섭취된 Jurkat 세포의 형광 신호로 평가했습니다. 데이터는 M0와 M2로 분화된 THP-1 세포 모두 유의미하게 높은 식세포 능력을 가지고 있으며, 이는 M2 대식세포의 항염증 기능과 일치합니다.