신경변성​ 개요

일차 쥐 대뇌 피질 뉴런(rCortical, Sartorius)을 PDL 코팅된 96웰 플레이트에 20,000개 세포/웰로 시딩하고 연구 기간 동안 Incucyte^®에 배치했습니다. 시딩 후 8일째, 세포를 용해되거나 응집된 Tau(헤파린 4:1 비율, 37°C, 5일 동안 산발적 회전)로 처리했습니다. 신경돌기 성장의 자동 분할 및 정량화가 수행되었습니다. 응집된 타우에서는 농도에 따라 신경돌기 길이가 감소했으며(80 ± 5 대 166 ± 3%, 2-3회 반복) 비응집된 타우는 150μg/mL에서 신경돌기 형성을 실질적으로 억제했습니다.

쥐의 일차 선조체와 성상교세포의 공동 배양물을 PDL 코팅된 96웰 플레이트(각각 20,000 및 15,000 세포/웰)에 시딩하고 Incucyte^® Neurolight-Orange(Sartorius)로 감염시켰습니다. 감염 후 10일 배양물을 세포사멸 마커 Incucyte^® Annexin V Green(0.5%, Sartorius)이 포함된 배지에서 6-OHDA(2~500μM)로 처리했습니다. Incucyte^® 라이브 셀 분석 시스템을 사용하여 형광 이미지를 실시간으로 캡처했습니다. 치료 후 21일에 6-OHDA 처리(19, 56 및 167 μM)를 비히클과 비교한 대표적인 이미지입니다. 시간 경과 및 약물 반응 곡선은 Annexin V 신호(녹색)의 해당 증가와 함께 신경돌기 길이(주황색)의 농도 의존적 ​​감소를 보여주며 약물 유해 효과를 보여줍니다. 데이터는 평균 ± SEM(3회 반복)으로 표시됩니다.

쥐의 일차 선조체, 흑색질 또는 피질 뉴런 및 성상교세포의 공동 배양을 PDL 코팅 96웰 플레이트(각각 20,000개의 뉴런 및 15,000개의 성상교세포/웰)에 시딩하고 Incucyte^® Neurolight-Orange(Sartorius)로 감염시켰습니다. 감염 후 10일 배양물을 6-OHDA(56~500μM)로 처리했습니다. Incucyte^® 라이브 셀 분석 시스템을 사용하여 형광 이미지를 실시간으로 캡처했습니다. 막대 그래프와 약물 반응 곡선은 다양한 뇌 영역의 신경돌기 길이(주황색)에 대한 약물의 선택적 프로필 효과를 보여줍니다. 차량 데이터는 뇌 영역 전체에 걸쳐 신경돌기 형성의 차별적인 발달을 보여줍니다. 데이터는 평균 ± SEM(3회 반복)으로 표시됩니다.

쥐 피질 뉴런과 쥐 성상교세포(Neuroprime^®, Sartorius)를 PDL 코팅된 96웰 플레이트에 공동 배양(각각 25,000개 및 15,000개 세포/웰)으로 시딩했습니다. 뉴런을 유전적으로 암호화된 칼슘 표시기 Incucyte^® Neuroburst-Orange(Sartorius)에 감염시켜 칼슘 변동 측정을 통해 시간 경과에 따른 자발적인 뉴런 활동을 모니터링했습니다. Incucyte^® 시스템에서 24시간마다 이미지를 촬영했습니다(초당 3프레임으로 3분 스캔). 성숙한 기능적 네트워크가 형성되면(14일), 세포를 AD 관련 펩타이드 타우(집합, 300μg/mL) 또는 단백질 포스파타제 억제제 OKA(50nM)로 처리했습니다. 이미지는 전체 스캔에 대한 활성 범위(최대/최소 형광)를 보여줍니다. 칼슘 흔적은 시야 내 모든 활성 물체의 칼슘 변동을 나타냅니다. 막대 그래프는 활성 개체 수(1/이미지)와 상관 관계(연결성)의 수량화를 제공합니다. 이 데이터는 차량과 비교하여 타우 처리가 활성 노드 수(1407 ± 94개 개체/이미지 대 920 ± 43개 개체/이미지)와 평균 강도(13.7 ± 1.7 OCU 대 7.2 ± 3.6 OCU)를 줄인 반면 상관 관계에는 영향을 미치지 않음을 보여줍니다(0.95 ± 0.01 대 0.97 ± 0.01, 2회 반복). 대조적으로 OKA는 차량에 비해 활성 노드 수(180 ± 24개 개체/이미지), 평균 강도(3.8 ± 0.3 OCU) 및 상관 관계(0.27 ± 0.02, 6개 반복)를 감소시켰습니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다.

건강한 및 AD(PSEN1 돌연변이) 유래 iPSC 뉴런(Axol Bioscience)을 ReadySet + SureBond 코팅 96웰 플레이트에 25,000개 세포/웰(2D)로 시딩하거나 ULA 96웰 플레이트에 50,000개 세포/웰로 시딩하고 원심분리했습니다(250g, 10분). 회전 타원체는 3일 동안 형성되도록 허용되었으며(3D), 공급업체의 프로토콜(보충제 A+B)에 따라 신경 분화가 유도되었습니다. 2D 연구: 신경돌기 발달은 Incucyte^® 소프트웨어 분석 모듈(Sartorius)을 사용하여 최대 15일 동안 자동으로 정량화되었습니다. 시간 경과에 따르면 환자에서 파생된 AD iPSC 계통은 건강한 대조군보다 더 낮은 신경돌기 길이를 나타냈습니다(48 ± 3mm/mm2 대 각각 80 ± 3mm/mm2, 3회 반복). 3D 회전 타원체 성장: 최대 15일 동안 명시야 분석을 사용하여 교란하지 않는 방식으로 크기 차이를 정량화했습니다. Matrigel^®(2.25 mg/mL)를 6일에 선택한 웰에 첨가하고, 추가 9일 동안 회전 타원체 형태 및 회전 타원체 본체의 공정 발달을 관찰했습니다. 시간 경과에 따라 두 세포주 모두에 대해 뚜렷한 회전 타원체 크기가 나타났습니다. 사진은 또한 건강한 라인과 알츠하이머 라인에 대한 차등 프로세스 개발 능력을 보여줍니다.