신경퇴행성 질환 개요

일차 랫드 피질 신경세포(rCortical, 싸토리우스)를 PDL 코팅된 96웰 플레이트에 20,000개의 세포/웰로 파종하고 연구 기간 동안 Incucyte^®에 배치했습니다. 파종 후 8일에, 세포를 용해된 또는 응집된 타우 단백질(헤파린 4:1 비율, 5일 동안 37°C에서 간헐적 회전)로 처리했습니다. 신경돌기 성장의 자동 분할 및 정량화를 수행했습니다. 응집된 타우는 농도 의존적으로 신경돌기 길이를 감소시켰으며(80 ± 5 대 166 ± 3 %, 2-3 반복), 비응집 타우는 150 µg/mL에서만 신경돌기 형성을 실질적으로 억제했습니다.

PDL 코팅된 96웰 플레이트에 쥐 일차 선조체와 별아교세포를 각각 20,000개와 15,000개씩 파종하고, Incucyte^® Neurolight-Orange (싸토리우스)로 감염시켰습니다. 감염 후 10일에 6-OHDA (2 – 500 µM)로 세포자멸 표지자인 Incucyte^® 아넥신 V Green (0.5%; 싸토리우스)을 포함한 배지로 처리했습니다. 형광 이미지는 Incucyte^® 생세포 분석 시스템을 사용하여 실시간으로 캡처했습니다. 대표 이미지는 21일 후 6-OHDA 처리(19, 56, 167 µM)와 용매를 비교하여 보여줍니다. 시간 경과 및 약물 반응 곡선은 신경돌기 길이(주황)의 농도 의존적 감소와 상응하는 아넥신 V 신호(초록)의 증가를 보여주어 약물의 유해한 효과를 나타냅니다. 데이터는 평균 ± 표준오차(3반복)로 제시됩니다.

싸토리우스의 Incucyte 신경 형광 오렌지를 사용하여 각 뇌 영역(선조체, 흑질, 대뇌 피질)의 일차 신경세포와 별아교세포를 PDL 코팅된 96웰 플레이트에 공동 배양했습니다(각각 신경세포 20,000개, 별아교세포 15,000개/웰). 감염 10일 후, 배양액에 6-OHDA(56 – 500 µM)를 처리했습니다. Incucyte 생세포 분석 시스템을 사용하여 실시간 형광 이미지를 캡처했습니다. 막대 그래프와 약물 반응 곡선은 서로 다른 뇌 영역의 신경돌기 길이(주황색)에 대한 약물의 선택적 프로필 효과를 보여줍니다. 대조군 데이터는 뇌 영역 간 신경돌기 형성의 차등적 발달을 보여줍니다. 데이터는 평균 ± 표준오차(3회 반복)로 제시됩니다.

래트 피질 뉴런과 래트 별아교세포(Neuroprime^®, 싸토리우스)를 PDL 코팅된 96웰 플레이트에 공동 배양(각각 25,000 및 15,000 세포/웰)했습니다. 뉴런은 칼슘 변동을 측정하여 자발적 신경 활동을 모니터링하기 위해 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표 Incucyte^® Neuroburst-Orange(싸토리우스)로 감염시켰습니다. 이미지는 Incucyte^® 시스템에서 24시간마다 촬영되었습니다(초당 3프레임으로 3분 스캔). 성숙하고 기능적인 네트워크가 형성된 후(14일), 세포는 알츠하이머병 관련 펩타이드 타우(응집, 300 μg/mL) 또는 단백질 인산가수분해효소 억제제 OKA(50 nM)로 처리되었습니다. 이미지는 전체 스캔에 걸친 활성 범위(최대/최소 형광)를 보여줍니다. 칼슘 트레이스는 시야 내 모든 활성 객체의 칼슘 변동을 나타냅니다. 막대 그래프는 활성 객체 수(1/이미지)와 상관관계(연결성)의 정량화를 제공합니다. 이 데이터는 차량 대비 타우 처리가 활성 노드 수(1407 ± 94 객체/이미지 대 920 ± 43 객체/이미지)와 평균 강도(13.7 ± 1.7 OCU 대 7.2 ± 3.6 OCU)를 감소시켰지만, 상관관계(0.95 ± 0.01 대 0.97 ± 0.01, 2회 반복)에는 영향을 미치지 않았음을 보여줍니다. 대조적으로, OKA는 차량 대비 활성 노드 수(180 ± 24 객체/이미지), 평균 강도(3.8 ± 0.3 OCU), 그리고 상관관계(0.27 ± 0.02, 6회 반복)를 감소시켰습니다. 데이터는 평균 ± 표준 오차로 제시되었습니다.

건강한 AD (PSEN1 돌연변이) 유래 iPSC 신경세포(Axol Bioscience)를 ReadySet + SureBond 코팅된 96웰 플레이트에 25,000세포/웰(2D) 또는 ULA 96웰 플레이트에 50,000세포/웰로 파종하고 원심분리(250 g; 10분)했습니다. 구형체는 3일 동안 형성되도록 하였고, 공급업체 프로토콜에 따라 신경세포 분화를 유도했습니다(보충제 A+B). 2D 연구: 신경돌기 발달은 최대 15일 동안 Incucyte^® 소프트웨어 분석 모듈(싸토리우스)을 사용하여 자동으로 정량화했습니다. 시간 경과 분석 결과, 환자 유래 AD iPSC 라인은 건강한 대조군보다 낮은 신경돌기 길이를 보였습니다(각각 48 ± 3 mm/mm2 및 80 ± 3 mm/mm2, 3회 반복). 3D 구형체 성장: 크기 차이를 비파괴적으로 최대 15일 동안 명시야 분석을 통해 정량화했습니다. Matrigel^®(2.25 mg/mL)를 6일에 선택된 웰에 추가하고, 추가 9일 동안 구형체 형태와 구형체 본체로부터의 과정 발달을 관찰했습니다. 시간 경과 분석 결과 두 세포주 모두 뚜렷한 구형체 크기를 보였습니다. 사진은 건강한 라인과 알츠하이머 라인의 차별적 과정 발달 능력을 보여줍니다.