항체 내재화

세포 표면 항원에 특이적인 항체는 세포 내로 항체가 유입되는 현상인 엔도사이토시스를 유도합니다. 항체가 세포 내로 유입되는 과정(Antibody Internalization, ABI)은 항체-약물 접합체(ADC)를 이용한 특정 암세포에 고독성 약물 전달, 암세포 표면 수용체(예: EGFR) 제거 또는 분해, 그리고 면역 세포 사멸을 위한 항체 면역 요법(예: ADCC 또는 ADCP) 등 연구 및 임상 개발에 다양한 강력한 응용 분야를 가지고 있습니다.

항체는 암, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 염증 및 감염성 질환을 포함한 다양한 질병 치료에 효과적인 치료제로 활용될 수 있는 치료적 중요성을 지니고 있습니다. 임상적으로 사용 가능한 항체를 개발하기 위해서는 효과적인 기능 분석을 통해 잠재적인 치료 효과를 평가하는 것이 필수적입니다. 기존의 항체-면역지수(ABI) 측정 기술은 다음과 같은 한계를 가지고 있습니다.

대량의 시료가 필요하기 때문에 데이터 수집 속도가 느리고 시료 채취 시간이 오래 걸립니다 (예: 기존 유세포 분석법).
신호 해상도 및 보정 최적화로 인해 구성이 복잡한 분석법을 사용하십시오.
항체 표지, 프로토콜 최적화, 고정 및 반복적인 세척과 같은 단계를 거쳐야 하므로 노동 집약적이고 시간이 많이 소요됩니다.
복잡한 수동 데이터 분석이 필요합니다
대량의 귀중한 시료와 항체를 사용해야 합니다.

iQue^® 항체 내재화 분석법은 iQue^® 항체 내재화 키트와 iQue^® 고처리량 스크리닝(HTS) 유세포 분석기를 결합하여 간소화된 워크플로우를 통해 항체 내재화를 고처리량으로 측정합니다. 귀중한 샘플과 시간을 절약하고 통합된 iQue Forecyt^® 소프트웨어를 사용하여 실시간 약리학적 분석을 수행하십시오. 부착 세포 또는 부유 세포에서 다양한 항체 패널의 항체 내재화를 정량화하는 것이 그 어느 때보다 쉬워졌습니다!

개념

The pH-sensitive fluorescent probe principle

그림 1. pH 감응성 형광 프로브의 원리.

새로운 pH 감응성 형광 프로브를 이용하면 혈청이 함유된 완전 배지에서 동종 항체를 세척 과정 없이 신속하게 표지할 수 있습니다. 세포 내로 유입된 항체가 산성 엔도솜 및 리소좀 경로로 이동하면서 형광 신호가 발생합니다. 항체 유입은 형광 프로브에 양성 반응을 보이는 생세포의 백분율로 정량화됩니다. 세포 생존율은 함께 제공되는 iQue^® 세포막 무결성 염색 시약을 사용하여 측정합니다.

주요 장점

- 고처리량 항체 발굴 프로세스의 일환으로 다양한 항체 패널의 세포 내 흡수율을 측정합니다.
- 선택한 부유 세포 또는 부착 세포 모델에서 여러 임상용 인간화 치료 항체의 특성을 분석하십시오.
- 복잡한 데이터를 신속하게 수집 및 분석하여 빠른 의사 결정을 내립니다.
- 단일 배양웰에서 함께 배양된 여러 세포 유형에서 항체 내재화를 동시에 평가하여 샘플 사용량을 크게 최소화합니다.

On the left, plate based heatmap of the internalization of the different antibodies in T-cells for easy visualization. On the right, serial dilution curves show internalization profiles of multiple labeled antibodies in T-cells

생산성을 극대화하세요

단일 웰에서 다양한 항체의 세포 내 유입을 측정하여 고처리량 항체 발굴을 가능하게 합니다.

그림 2. iQue Forecyt^®를 이용한 항체 활성의 효율적인 평가.

T세포를 이용한 항체 내재화 분석을 통해 384웰 플레이트의 각 웰에서 고함량 데이터를 생성했습니다. 여러 항체에 항체 내재화 시약을 표지한 후 동일한 웰에서 T세포와 함께 배양했습니다. (A) T세포 내 다양한 항체의 내재화를 쉽게 시각화할 수 있도록 플레이트 기반 히트맵을 작성했습니다. (B) 연속 희석 곡선은 T세포에서 여러 표지 항체의 내재화 양상을 보여줍니다.

Functional screening and viability analysis in both non-adherent and adherent cell types

유연한 분석 형식

96웰 또는 384웰 플레이트에서 ADCP를 신속하게 정량화할 수 있는 검증된 시약을 사용하여 연구 결과를 더욱 효율적으로 도출하십시오.

그림 3. 비부착성 세포와 부착성 세포 모두에서 기능적 스크리닝 및 생존력 분석.

프로토콜을 약간 수정하면 부착성 세포 유형에도 적용할 수 있습니다. 데이터는 부유 상태의 Ramos 세포에서 리툭산(항-CD20)과 부착성 AU565 세포에서 허셉틴(항-Her2) 두 가지 치료용 항체의 농도 의존적 활성을 세포 생존율과 함께 평가한 결과를 보여줍니다. 세포를 96웰 플레이트에 접종하고, ABI 시약과 복합된 항체를 iQue^® 세포막 무결성 염색 시약과 함께 첨가하여 3시간 동안 배양했습니다. 부유 세포는 iQue^®(HTS) 플랫폼에서 즉시 분석했으며, 부착 세포는 분석 전에 조심스럽게 분리하여 재현탁했습니다.

Internalization of Herceptin antibody isotypes in Her2+ AU565 and Her2- MDA-MB 468 cells.

데이터 수집 및 분석 과정을 간소화하세요

복잡한 데이터를 빠르고 쉽게 수집, 분석 및 제시하여 신속한 의사 결정을 지원합니다.

그림 4. Her2+ AU565 세포와 Her2- MDA-MB 468 세포에서 허셉틴 항체 동위형의 세포 내 유입.

세포를 96웰 플레이트에 접종하고 ABI 시약과 복합체를 형성한 다양한 허셉틴 동위효소로 처리하였다(A. AU565, B. MDA-MB-468). Her2- 세포에서는 세포 내 유입이 측정되지 않았다. 또한, AU565 세포에서 다양한 활성도를 나타내는 허셉틴 동위효소에 대한 연속 희석 곡선을 작성하였다(C).

Internalization analysis of co-cultured cells in a single well provides robust data from small volumes of sample

소중한 샘플에서 더 많은 생물학적 통찰력을 얻으세요

표현형이 서로 다른 세포 유형들을 하나의 배양웰에서 함께 배양했을 때, 특정 항체의 세포 내 유입을 동시에 평가합니다.

그림 5. 단일 배양웰에서 공동 배양된 세포의 세포 내 유입 분석은 적은 양의 샘플로도 신뢰할 수 있는 데이터를 제공합니다.

96웰 플레이트에 세포를 접종하기 전에, 세포에 무해한 iQue^® 세포 인코딩 염료(V/Blue)를 다양한 농도로 처리하여 염색했습니다. 단일 세포 배양과 공동 배양 모두 하룻밤 동안 세포가 부착되도록 했습니다. 허셉틴 또는 hIgG1을 항체 내재화 시약과 복합체를 형성시킨 후, iQue^®(HTS) 플랫폼을 사용하여 분석하기 3시간 전에 첨가했습니다. 산점도(A)는 인코딩 염료를 기준으로 동일한 웰에 혼합된 세 가지 세포 유형을 쉽게 식별할 수 있도록 합니다. 각 세포 집단에서 내재화를 평가할 수 있으며(B), 귀중한 시료와 시험 항체 사용량을 최소화하면서 시험 항체로부터 얻을 수 있는 정보를 극대화할 수 있습니다.

Schematic of the iQue® Antibody Internalization Kit highlighting its simplicity and ease of use

그림 6. iQue^® 항체 내재화 키트의 개략도. 키트의 단순성과 사용 편의성을 강조함..

이 분석법은 표지된 시험 항체, 세포(보라색 인코딩은 선택 사항), iQue^® 세포막 무결성 염료(흑색/녹색)의 세 가지 구성 요소(각 10µL)로 이루어져 있습니다. 각 구성 요소는 최종 농도가 1배가 되도록 3배 농도로 제조한 후 첨가하며, 분석 총량은 30µL입니다.

간편한 라벨링 단계는 초기 단계 하이브리도마 스크리닝에 적합한 완전 배지에서 수행할 수 있으며, 소량의 항체만 필요하고, 다중 스크리닝(내재화 및 세포 건강 상태 판독)을 위해 여러 세포 유형에 대해 테스트할 수 있습니다.

자주 묻는 질문(FAQ)

항체 내재화 분석에 대해 검증된 시간 범위는 무엇입니까?

iQue^® 항체 내재화 키트는 총 4시간 동안 매시간 데이터를 수집하는 방식으로 검증되었습니다. 이 범위는 여러 수용체에 적합한 것으로 나타났지만, 분석 대상 수용체마다 최적화하는 것이 좋습니다.

이 제품은 항체 단편과 호환됩니까?

항체 내재화 시약은 Fc 영역에 결합하여 항체에 접합됩니다. 사용되는 항체의 종류와 관계없이, 표지화되려면 반드시 이 Fc 영역을 가지고 있어야 합니다.

고처리량 스크리닝(HTS) 유세포 분석법이 다른 항체 특성 분석 기법보다 우수한가? 그렇다면 그 이유는 무엇인가?

iQue^®는 HTS 유세포 분석기로, 항체 특성 분석에 사용되는 기존 유세포 분석법 및 공초점 현미경보다 훨씬 뛰어난 장점을 제공합니다. 기존 기술은 많은 양의 시료(기존 유세포 분석법) 또는 이미지 촬영이 필요하기 때문에 데이터 획득 시간이 길고, 최적화 과정이 일반적으로 더 복잡합니다. 또한 항체 표지, 프로토콜 최적화, 고정 및 반복적인 세척과 같은 단계를 거쳐야 하므로 훨씬 더 많은 시간과 노력이 필요합니다. iQue^® 항체 내재화 키트와 달리, 이러한 기존 방법들은 복잡한 수동 데이터 분석을 요구합니다.