항체 내재화

세포 표면 항원에 특이적인 항체는 엔도사이토시스를 유도하여 해당 항체와 함께 결합된 분자들의 세포 내부화를 야기합니다. 이 과정을 항체 내재화(ABI)라고 하며, 항체 약물 접합체(ADCs)를 통한 특정 암세포로의 고독성 약물 전달, 암세포의 표면 수용체 제거 또는 분해(예: EGFR), 그리고 면역세포 살해를 위해 종양 세포를 식별하는 항체 면역치료(예: ADCC 또는 ADCP)와 같은 연구 및 임상 발견에 많은 강력한 응용 분야가 있습니다.

암, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 염증 및 감염성 질환을 포함한 다양한 영역에서 질병 치료를 위한 항체의 치료적 중요성은 광범위합니다. 임상용 항체를 개발하기 위해서는 효과적인 기능성 검사를 통해 잠재적 치료 중요성을 평가하는 것이 필수적입니다. ABI를 측정하기 위한 전통적인 기술은 종종:

대량의 샘플 볼륨 요구로 인해 처리량이 낮고 샘플 시간이 긴 획득 방식을 가짐 (예: 기존 유세포 분석법)
신호 해상도 및 보상 최적화로 인해 구성이 복잡한 분석법 사용
항체 표지, 프로토콜 최적화, 고정 및 반복적인 세척 등의 단계가 필요한 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되는 과정
복잡한 수동 데이터 분석 필요
대량의 귀중한 샘플 및 항체 사용 필요성

iQue^® 항체 내재화 분석은 iQue^® 항체 내재화 키트와 iQue^® 고처리량 스크리닝(HTS) 사이토미터를 결합하여, 간소화되고 효율적인 워크플로우를 통해 항체 내재화를 고처리량으로 측정합니다. 통합된 iQue Forecyt^® 소프트웨어를 사용하여 귀중한 샘플과 시간을 절약하고 실시간 약리학적 분석을 얻으세요. 부착성 또는 부유성 세포에서 다양한 항체의 항체 내재화를 정량화하는 것이 이보다 쉬울 수 없습니다!

개념

그림 1. pH 감응성 형광 프로브 원리.

완전한 혈청 함유 배지에서 이소타입 일치 항체를 빠르고 세척 없이 표지할 수 있는 새로운 pH 감응성 형광 프로브를 활용합니다. 내재화된 항체가 산성 엔도좀 및 리소좀 경로로 처리될 때 형광 신호가 생성됩니다. 항체 내재화는 형광 프로브에 양성인 생존 세포의 비율로 정량화됩니다. 세포 생존성은 포함된 iQue^® 세포막 무결성 염료를 사용하여 측정됩니다.

주요 장점

- 고처리량 항체 발견 과정의 일환으로 다양한 항체의 세포 내재화 측정
- 선택한 부유성 또는 부착성 세포 모델에서 여러 임상 인간화 치료 항체 특성 규명
- 복잡한 데이터를 신속하게 수집 및 분석하여 의사결정 가속화
- 단일 웰에서 공동 배양된 서로 다른 세포 유형에서 항체 내재화를 동시에 평가하여 샘플 사용을 크게 최소화

생산성 극대화

단일 웰에서 항체 패널의 세포 내부화를 측정하여 고처리량 항체 발견 가능

그림 2. iQue Forecyt^®를 사용한 항체 활성의 효율적인 평가

T-세포를 항체 내재화 분석에 사용하여 384웰 플레이트의 각 웰에서 고함량 데이터를 생성했습니다. 여러 항체를 동일한 웰에서 T-세포와 배양하기 전에 항체 내재화 시약으로 표지했습니다. (A) T-세포에서 다양한 항체의 내재화를 쉽게 시각화할 수 있는 플레이트 기반 히트맵. (B) 연속 희석 곡선은 T-세포에서 여러 표지된 항체의 내재화 프로파일을 보여줍니다.

유연한 분석 형식

96 또는 384-웰 플레이트에서 ADCP의 신속한 정량을 위해 검증된 시약을 사용하여 발견을 촉진하세요.

그림 3. 비부착성 및 부착성 세포 유형에서의 기능성 스크리닝 및 생존성 분석

프로토콜을 약간 변경하면 이 분석법을 부착성 세포 유형에 사용할 수 있습니다. 데이터는 현탁 Ramos 세포의 Rituxan(항-CD20)과 부착성 AU565 세포의 Herceptin(항-Her2) 등 두 가지 치료용 항체의 농도 관련 활성을 보여줍니다. 세포를 96-웰 플레이트에 파종한 후, ABI 시약과 복합된 항체를 iQue^® 세포막 무결성 염료와 함께 첨가하고 3시간 동안 배양했습니다. 현탁 세포는 즉시 iQue^® (HTS) 플랫폼에서 분석했고, 부착성 세포는 주의 깊게 분리하여 재현탁한 후 분석했습니다.

데이터 획득 및 분석 간소화

복잡한 데이터를 빠르고 쉽게 수집, 분석 및 제시하여 신속한 의사 결정 지원

그림 4. Her2+ AU565 및 Her2- MDA-MB 468 세포에서 허셉틴 항체 이소타입의 내재화

세포를 96웰 플레이트에 파종하고 ABI 시약과 복합된 다양한 이소타입의 허셉틴으로 처리했습니다(A. AU565, B. MDA-MB-468). Her2- 세포에서는 내재화가 측정되지 않았습니다. AU565에서 허셉틴 이소타입에 대한 연속 희석 곡선도 수행되었으며(C) 다양한 활성을 보여줍니다.

귀중한 샘플로부터 더 많은 생물학적 통찰 얻기

단일 웰에서 공배양된 표현형적으로 구별되는 세포 유형의 특정 항체 내재화 동시 평가

그림 5. 단일 웰에서 공배양된 세포의 내재화 분석은 소량의 샘플로부터 강력한 데이터 제공

96 웰 플레이트에 세포를 파종하기 전, 세포들은 비교란성 iQue^® 세포 인코딩 염료(V/Blue)의 다른 농도로 염색되었습니다. 단일 및 공배양된 세포들은 밤새 부착되었습니다. Herceptin 또는 hIgG1이 항체 내재화 시약과 복합체를 형성하여 3시간 동안 추가된 후 iQue^® (HTS) 플랫폼을 사용하여 분석되었습니다. 산점도(A)는 인코딩 염료를 기반으로 동일한 웰에 혼합된 세포 3가지 유형을 쉽게 식별할 수 있게 합니다. 내재화는 각 집단(B)에서 평가될 수 있어, 귀중한 샘플과 시험 항체의 양을 최소화하면서 시험 항체로부터 얻을 수 있는 정보를 최대화합니다.

그림 6. iQue^® 항체 내재화 키트의 개략도, 그 단순성과 사용 용이성 강조.

이 분석법은 각각 10 µL의 3가지 구성 요소로 구성됩니다: 표지된 테스트 항체, 세포(바이올렛 인코딩 선택 사항), 그리고 iQue^® 세포막 무결성 염료(B/그린). 각 구성 요소는 최종 농도 1X와 분석 부피 30 µL를 위해 첨가 전 3X로 준비됩니다.

쉬운 표지 단계는 초기 단계 하이브리도마 스크리닝에 적합한 완전 배지에서 수행될 수 있으며, 적은 양의 항체가 필요하고, 다중 세포 유형에서 테스트할 수 있어 다중 스크리닝 – 내재화 및 세포 건강 판독이 가능합니다.

자주 묻는 질문

항체 내재화 분석에 대해 어떤 시간대가 검증되었습니까?

iQue^® 항체 내재화 키트는 총 4시간에 걸쳐 매 시간마다 획득 범위를 사용하여 검증되었습니다. 이 범위는 여러 수용체에 적합한 것으로 확인되었지만, 분석되는 각 수용체에 대해 최적화가 권장됩니다.

이 제품은 항체 단편과 호환 가능합니까?

항체 내재화 시약은 Fc 영역에 결합하여 항체와 결합됩니다. 사용되는 항체 유형에 관계없이 라벨링하려면 이 Fc 영역이 있어야 합니다.

고처리량 선별 검사(HTS) 세포 측정법이 다른 항체 특성 분석 기술보다 우수한가? 만약 그렇다면, 왜 그런가?

iQue^®는 HTS 세포 측정기로, 항체 특성 분석에 사용되는 기존 유세포 분석법 및 공초점 현미경과 비교해 상당한 장점을 제공합니다. 기존 기술들은 대용량 샘플(기존 유세포) 또는 이미징으로 인해 획득 시간이 길며, 이러한 분석은 일반적으로 최적화하기가 더 복잡합니다. 이러한 대안적 방법들은 항체 표지, 프로토콜 최적화, 고정 및 반복적인 세척과 같은 단계가 필요해 훨씬 더 노동 집약적이고 시간이 많이 소요됩니다. 그리고 iQue^® 항체 내재화 키트와 달리, 이러한 방법들은 복잡한 수동 데이터 분석이 필요합니다.