세포 계측법을 이용한 고처리량 스크리닝(HTS)을 통한 iPSC 특성 분석 및 후속 응용

그림 3. 고처리량 다중 분석법을 사용하여 여러 iPSC 계열의 다능성 및 생존력을 특성화합니다.

Three iPSC lines were labelled using fluorophore conjugated anti-SSEA-1 (marker of differentiated cells), anti-SSEA-4 and anti-TRA-1-60 (two pluripotency markers) antibodies and a viability dye (iQue^® Cell Membrane Integrity Dye (B/Red). THP-1 cells were also labelled as a differentiated cell control and NCCIT cells as a control cell line known to express stem cell pluripotency markers. Marker expression and viability were measured using the iQue^® High-Throughput Screening Cytometer. (A) Table listing cell lines, and characteristics. (B) Marker expression as a percentage of live cells for each cell type. Pluripotent refers to SSEA-1 negative, SSEA-4 and TRA-1-60 double positive phenotype. (C) Heat map showing % viability for each cell type (n=4). (D) Incucyte^® images of colonies of each iPSC cell line taken 48 hours after seeding illustrating tightly packed colony morphology.

그림 4. 2D 및 3D 배양된 iPSC에서 다능성을 유지하기 위한 최적의 성장 조건을 평가합니다.

최적화된(mTESR Plus 2D 및 일반 계대배양 3D) 및 최적화되지 않은(RPMI 2D 및 계대배양 없음 3D) 배양 조건에서 iPSC를 2D(A) 및 3D(B)에서 배양하여 2D에서는 4일, 3D에서는 18일 동안 '분화'를 유도했습니다(± SEM, n=4). '만능줄기세포'는 SSEA-1 음성이면서 SSEA-4 및 TRA-1-60에 모두 양성인 세포 집단으로, 만능줄기세포를 나타냅니다. iQue^® HTS 플랫폼으로 2D에서 4일, 3D에서 18일 동안 배양한 후 수집한 원시 데이터를 도트 플롯으로 나타내어 최적화된 iPSC와 최적화되지 않은 iPSC를 비교했습니다. 최적화되지 않은 iPSC에서 SSEA-1 발현의 변화와 그에 따른 만능줄기세포 마커 발현의 소실을 확인할 수 있습니다(n=4). 최적화된 성장 조건과 최적화되지 않은 성장 조건에서 배양된 iPSC는 분화와 관련된 2D 및 3D 형태에서 뚜렷한 차이를 보이며, Incucyte^®를 사용하여 효과적으로 이미지를 촬영하고 분석할 수 있습니다(대표 이미지는 10배 확대하여 촬영했으며, 스케일 바는 400μm를 나타냅니다).

그림 5. 마커 발현 및 형태학적 분석을 통해 iPSC 분화의 특성을 규명한다.

Expression of markers in the hepatocyte differentiation pathway, definitive endoderm (CD184) and mature hepatocytes (CD99), were measured on the iQue^®. AU565 cells were used as a differentiated cell control. HepG2s were included as a liver cell line. (에이) Table describing cell line characteristics. (비) Percentage expression analysis shows marker expression of control cells from a single timepoint (left), and changes in hepatocyte marker expression of iPSCs during differentiation into hepatocytes (right). (기음) Contour plots show CD184 expression over time and Incucyte^® images from representative time points show morphological and spatial changes in cells during differentiation compared to iPSCs grown conventionally in mTESR.