세포 분석을 통한 고처리량 스크리닝(HTS)을 이용한 iPSC 특성화 및 하위 응용

그림 3. 고처리량, 다중화 분석을 사용하여 다중 iPSC 계통의 다능성과 생존력 특성화

세 가지 iPSC 계통에 형광 접합 항-SSEA-1(분화된 세포 마커), 항-SSEA-4 및 항-TRA-1-60(두 가지 다능성 마커) 항체와 생존성 염료(iQue^® 세포막 무결성 염료(B/Red))로 표지했습니다. THP-1 세포는 분화된 세포 대조군으로, NCCIT 세포는 줄기세포 다능성 마커를 발현하는 것으로 알려진 대조 세포주로 표지했습니다. 마커 발현과 생존성은 iQue^® 고처리량 스크리닝 세포계측기를 사용하여 측정했습니다. (A) 세포주 및 특성을 나열한 표. (B) 각 세포 유형의 생존 세포 중 마커 발현 비율. 다능성은 SSEA-1 음성, SSEA-4 및 TRA-1-60 이중 양성 표현형을 의미합니다. (C) 각 세포 유형의 생존율 열 지도(n=4). (D) 밀집된 군체 형태를 보여주는 각 iPSC 세포주의 군체의 Incucyte^® 이미지(파종 후 48시간).

그림 4. 2D 및 3D 배양된 iPSC에서 만능성 유지를 위한 최적 성장 조건 평가

iPSC는 최적화된 조건(mTESR Plus 2D 및 정기적인 3D 계대배양)과 최적화되지 않은 조건(RPMI 2D 및 3D 계대배양 없음)에서 2D는 4일, 3D는 18일 동안 '분화'를 유도하여 배양되었습니다(± SEM, n=4). '만능성' 세포는 SSEA-1 음성이면서 SSEA-4와 TRA-1-60에 모두 양성인 세포 집단으로, 만능성 세포를 나타냅니다. iQue^® HTS 플랫폼에서 수집된 원시 데이터를 보여주는 도트 플롯은 2D 4일과 3D 18일에 최적화된 및 최적화되지 않은 iPSC를 비교하며, 최적화되지 않은 iPSC의 SSEA-1 발현 변화와 이에 따른 만능성 마커 발현 감소를 주목할 만합니다(n=4). 최적화된 및 최적화되지 않은 성장 조건에서 배양된 iPSC는 2D와 3D 모두에서 분화와 연관된 뚜렷한 형태학적 차이를 보이며, 이는 Incucyte^®를 사용하여 효과적으로 이미징 및 분석할 수 있습니다(10배 배율로 촬영한 대표 이미지, 눈금 막대는 400 μm를 나타냄).

그림 5. 마커 발현 및 형태학적 분석을 통한 iPSC 분화 특성 규명

간세포 분화 경로의 마커 발현, 확정적 내배엽(CD184)과 성숙 간세포(CD99)의 발현이 iQue^®에서 측정되었습니다. AU565 세포는 분화된 세포 대조군으로 사용되었습니다. HepG2는 간 세포주로 포함되었습니다. 세포주 특성을 설명하는 표. 발현 비율 분석은 단일 시점의 대조군 세포 마커 발현(왼쪽)과 간세포로의 분화 과정 중 iPSC의 간세포 마커 발현 변화(오른쪽)를 보여줍니다. 등고선 그래프는 시간에 따른 CD184 발현을 보여주며, Incucyte^® 이미지는 대표적인 시점에서 mTESR에서 일반적으로 배양된 iPSC와 비교한 분화 중 세포의 형태학적, 공간적 변화를 보여줍니다.