Apoptosis - cells highlighted in green on gray background - Incucyte software screenshot

Incucyte® 생세포 분석을 위한 세포 사멸 분석법

자세히 알아보기: 세포사멸의 운동학적 정량화

세포사멸 분석

세포사멸은 정상적인 조직 발달과 항상성 유지에 필수적인 과정으로, 세포가 적절한 시기에 프로그램된 세포사를 겪는 과정입니다. 세포사멸 신호전달의 이상은 암, 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환을 비롯한 다양한 인간 질병과 관련이 있습니다. 세포사멸 유도는 대부분 카스파제(시스테이닐 아스파르트산 프로테아제)의 활성화와 세포막 변형을 초래합니다. 카스파제-3 또는 카스파제-7의 활성화는 세포를 세포사멸로의 비가역적 전환을 유도하며, 세포사멸의 신뢰할 수 있는 지표로 여겨집니다. 세포막 인지질세린(PS) 대칭성의 조절된 소실 또한 세포사멸의 대표적인 지표입니다. 사멸하는 세포는 일반적으로 세포 안쪽을 향하는 PS가 세포 표면으로 이동하게 되는데, 이는 주변 식세포에 의한 사멸 세포의 조기 인식을 가능하게 합니다.

카스파제-3/7 활성화 또는 PS 외부화를 측정하기 위해 수많은 효소법, 플레이트 판독기법 및 유세포 분석법이 개발되었습니다. 대부분의 카스파제-3/7 분석법은 효소가 인식하는 DEVD(Asp-Glu-Val-Asp) 펩타이드 모티프를 포함하는 루시페라제, 비색법 또는 형광법 시약 기질을 사용합니다. 안넥신 V는 PS 잔기에 대한 높은 친화도와 선택성을 가진 재조합 단백질로, 세포 사멸 검출에 사용될 수 있습니다. 형광 프로브가 접합된 안넥신 V를 이용한 세포 사멸 분석법은 PS 외부화 검출에 최적화되어 있으며, 가장 일반적으로 유세포 분석법으로 측정됩니다. 일반적인 세포 사멸 분석법의 주요 단점은 다음과 같습니다.

  • 사용자가 임의로 정의한 단일 최종 측정값을 산출합니다.
  • 여러 번의 세척 단계 또는 세포 분리 과정이 필요하며, 이로 인해 사멸하는 세포가 손실되거나 PS 비대칭성이 저하될 수 있습니다.
  • 시간이 지남에 따라 신호 배경이 증가하기 때문에 장기간 측정에는 적합하지 않습니다.

Incucyte® 생세포 분석 시스템은 Incucyte® 혼합 및 판독 방식을 사용하여 여러 세포 사멸 경로를 동시에 실시간으로 측정하는 실시간 자동화 세포 사멸 분석을 가능하게 합니다.


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Incucyte® 세포사멸 분석의 주요 장점

Incucyte®의 세포사멸 관련 논문을 보려면 여기를 클릭하세요.
Real-time visualization of HT-1080 Cells with Caspase 3/7 data figure
Real-time visualization of HT-1080 Cells with Caspase 3/7 data figure
Lab technician preparing the Incucyte instrument in laboratory incubator for live-cell analysis
Incucytle Caspase3-7--Annexin-V-signals -en-L-Sartorius
타임랩스 이미징을 이용하여 세포 사멸을 시각화하고 정량화합니다.

Incucyte®의 직관적인 이미지 분석 도구를 사용하여 시간에 따른 세포 사멸을 관찰하고 사멸 세포 수를 정량화하세요. 형태학적 변화를 시각화하고 이미지와 동영상을 통해 치료 효과를 검증하세요.


아래 예시 데이터를 참조하세요.
   

배양기 내부에서 세포 사멸의 시간 경과를 자동으로 분석합니다.

세포를 배양기의 안정적인 환경에서 꺼내지 않고 치료 효과가 언제 어떻게 나타났는지 확인할 수 있습니다. 이는 장기 연구(0일~10일 이상)에 이상적입니다.

간편한 혼합 및 판독 방식의 96/384웰 프로토콜

세포를 배양 접시에 담고, Incucyte® Caspase-3/7 또는 Incucyte® Annexin V 염료와 함께 처리제를 첨가한 후, Incucyte® 생세포 분석 시스템에서 반응 속도를 측정합니다. 세척, 고정 또는 세포 분리 과정이 필요 없습니다.

두 가지 서로 다른 경로를 통해 세포사멸을 감지하고 확인합니다.

세포 사멸 기전으로서 세포 사멸을 확인하기 위한 멀티플렉스 인큐사이트® 카스파제-3/7 및 안넥신 V 염색법.

세포 증식 및 세포 독성 측정을 포함하는 멀티플렉스

Incucyte® 세포사멸 분석 키트를 Incucyte® Nuclight 시약 또는 Cytotox 염료와 함께 사용하여 증식/세포독성을 다중 측정할 수 있습니다. 세포독성 및 세포증식 억제 치료 효과를 쉽게 구분할 수 있습니다.

세포 사멸 분석을 위한 예시 데이터

타임랩스 이미징을 이용하여 세포 사멸을 시각화하고 정량화하세요

그림 1. Incucyte® 세포 사멸 분석 및 이미지 분석 도구를 사용하여 선택한 세포에서 세포 사멸을 정량화하십시오..

  • 캠프토테신(100 µM)과 Incucyte® Caspase-3/7 녹색 염료가 존재하는 조건에서 HT-1080 육종 세포의 Incucyte® 이미지를 관찰하였다. Caspase-3/7 형광 녹색 신호와 함께 나타나는 특징적인 세포 수축 및 세포막 돌출 현상을 확인할 수 있다.
  • Incucyte® 이미지 분석 도구는 세포 사멸을 겪는 종양 세포(분홍색 마스크)를 자동으로 계수할 수 있도록 합니다.
  • Incucyte® Caspase-3/7 Red Dye 존재 하에 TNFα 및 시클로헥시미드로 처리한 MDA-MB-231 유방 선암 세포의 Incucyte® 이미지.
  • Incucyte® 이미지 분석 도구는 세포 사멸을 겪는 종양 세포(연한 파란색 마스크)를 자동으로 계수할 수 있도록 합니다.
  • 캠프토테신(1 µM)과 Incucyte® Annexin V Red 염료가 존재하는 조건에서 Jurkat T 림프구 세포의 Incucyte® 이미지.
  • 자동 이미지 분석(파란색 마스크)을 통해 세포 사멸을 겪는 면역 세포를 직접 감지할 수 있습니다.
  • (오른쪽 상단) Incucyte® image of primary rat forebrain neurons in co-culture with astrocytes in the presence of glutamate (300 µM) and Incucyte® Annexin V Green Dye. Neurons are selectively labeled with the Incucyte® Neurolight Red Lentivirus.
  • 분석된 이미지(파란색 마스크)는 세포 사멸을 나타내는 세포를 양성으로 표시합니다.

배양기 내부에서 세포 사멸의 시간 경과를 자동으로 분석하세요

Incucyte® 세포 사멸 분석 키트는 96/384웰 플레이트의 모든 웰을 자동으로 이미지화하고 분석하여 시간에 따른 세포 사멸을 마이크로플레이트 단위로 판독할 수 있도록 합니다. 시간 경과 분석을 통해 농도 의존적인 처리 효과를 확인할 수 있습니다. 데이터를 농도-반응 곡선으로 변환하여 약리학적 효과를 비교할 수 있습니다. 각 시점의 이미지를 통해 정량 분석 결과를 검증할 수 있습니다.

간편한 혼합 및 판독 방식의 96/384웰 프로토콜 - 세척, 수정, 리프팅 불필요

중/고처리량 스크리닝을 위해 최대 6개의 384웰 플레이트를 동시에 판독할 수 있습니다.

두 가지 서로 다른 경로를 통해 세포 사멸을 감지하고 확인합니다.

배양액에서 카스파제-3/7 및 안넥신 V 신호를 모두 검출합니다. 세포 사멸의 시간 경과를 자동으로 측정합니다.

세포 증식 및 세포 독성 측정을 포함한 멀티플렉스

캄토테신(1 µM) 또는 시클로헥시미드(1 µM)로 처리한 HT-1080 섬유육종 세포를 Incucyte® Annexin V Green Dye 존재 하에 24시간 동안 배양하여 세포 사멸을 검출하였다(사멸 세포는 마스킹 처리됨). 녹색(세포 사멸) 집단을 식별하는 분류 플롯(두 번째 열), 시간 경과 플롯(세 번째 열) 및 농도-반응 곡선(네 번째 열)은 세포 독성 및 세포 증식 억제 화합물의 효과 차이를 보여준다.

세포 사멸 분석을 위한 솔루션

Incucyte® 세포사멸 분석 개요

Incucyte® 생세포 분석 시스템은 조직 배양기 내에서 실시간 자동화된 세포 사멸 분석을 가능하게 합니다. Incucyte® Caspase-3/7 및 Annexin V 염료를 혼합하여 판독하는 방식으로 여러 세포 사멸 경로를 동시에 실시간으로 측정할 수 있습니다. 세포 사멸 신호를 Incucyte® 고해상도 위상차 현미경 이미지와 연관시켜 세포 사멸에 대한 추가적인 생물학적 통찰력과 형태학적 검증(예: 세포 수축, 세포막 돌출, 핵 응축)을 얻을 수 있습니다.

  • Incucyte® Caspase-3/7 염료는 세포막을 자유롭게 통과하는 불활성 비형광(DEVD) 기질로서, 활성화된 caspase-3/7에 의해 절단되어 녹색 또는 적색의 DNA 결합 형광 표지를 방출합니다. 세포 사멸은 핵에 형광 표지가 나타나는 것으로 식별됩니다.
  • Incucyte® Annexin V 염료는 세포 사멸 과정에서 노출된 PS에 결합할 때 녹색, 빨간색, 주황색 또는 근적외선 형광 신호를 방출하는 매우 밝고 광안정성이 뛰어난 CF 염료로 표지되어 있습니다.

Incucyte® 세포 사멸 분석법을 사용하여 종양, 면역 또는 신경 세포 배양에서 세포 사멸을 측정하십시오.

TNFα와 시클로헥시미드를 처리한 Incucyte® Nuclight Green으로 표지된 MDA-MB-231 인간 유방 선암 세포(왼쪽)와 캄토테신을 처리한 Jurkat T 림프구 세포(오른쪽)에서 실시간으로 세포 사멸을 검출했습니다. 세포 사멸 세포는 Incucyte® Caspase-3/7 Red Dye 또는 Annexin V Red Dye를 사용하여 각각 붉게 표지했습니다. 세포 사멸 세포는 Incucyte® Live-Cell Analysis System을 사용하여 실시간으로 정량화했습니다.

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Incucyte Caspase-3/7 Dyes product guide cover

제품 가이드: IncucyteCaspase-3/7 염료

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세포사멸 분석 관련 자주 묻는 질문

네, 원칙적으로 가능합니다. Incucyte® Caspase-3/7 및 Annexin V 프로토콜은 다양한 부착성 및 비부착성 세포주를 사용하여 최적화되었으므로 암세포, 면역 세포, 신경 세포를 포함한 모든 세포 유형에 적용할 수 있습니다. 다만, 일부 세포 유형(예: MCF-7 세포)에서는 Caspase-3 발현이 나타나지 않을 수 있습니다. 이러한 세포의 경우, 세포 사멸 측정을 위해 Incucyte® Caspase-3/7 염료 대신 Incucyte® Annexin V 염료를 사용하는 것을 권장합니다.


네. 여기에 설명된 프로토콜과 데이터는 Jurkat 인간 T 림프구 세포와 같은 부유 세포주에서 세포 사멸을 정량화하는 것이 가능하다는 것을 보여줍니다. 부유 세포가 관찰 범위 내에 유지되도록 플레이트를 코팅하는 것이 좋습니다. 폴리-L-오르니틴, 폴리-D-리신 또는 Matrigel™과 같은 코팅제가 효과적인 것으로 알려져 있습니다.


예. 단, 해당 형광 물질이 Incucyte® 생세포 분석 시스템과 호환되고, Incucyte® Caspase3/7 또는 Annexin V 염료에서 방출되는 형광 신호를 방해하지 않는 경우에 한합니다.


네. 여기에 설명된 프로토콜과 데이터는 단일 웰에서 두 가지 세포사멸 지표(예: 카스파제-3/7 활성화 및 포스파티딜세린 외부화)를 정량화하는 것이 가능하다는 것을 보여줍니다. 예를 들어, 이를 위해 Incucyte® Annexin V Red Dye(제품 번호 4641)와 Incucyte® Caspase-3/7 Dye(제품 번호 4440)를 이중으로 사용하는 것을 권장합니다.


네. Incucyte® Caspase-3/7 염료 또는 Incucyte® Annexin 염료를 다른 색상의 Incucyte® Cytotox 염료와 함께 사용하여 다른 세포 사멸 지표를 평가할 수 있습니다.


예. Incucyte® Annexin V Red Dye(제품 번호 4641)와 프로피디움 아이오다이드를 이중으로 사용할 수 있습니다. 프로피디움 아이오다이드 신호는 Incucyte® Live-Cell Analysis System의 적색 채널을 사용하여 정량화하고, 스펙트럼 분리 매개변수를 적색과 녹색의 80%로 설정하는 것을 권장합니다(자세한 내용은 형광 염료 최적화 기술 노트를 참조하십시오).


표시된 데이터는 10배율 및 20배율 대물렌즈를 사용하여 얻은 결과이지만, 4배율 대물렌즈를 사용해도 동일한 분석이 가능합니다. 10배율 대물렌즈는 더 넓은 시야를 제공하여 웰당 필요한 이미지 수를 줄여줍니다. 더 높은 공간 해상도를 얻으려면 20배율 대물렌즈를 사용하는 것이 좋습니다.


Incucyte® 세포 사멸 분석은 Incucyte® 생세포 분석 시스템에서 지원되는 투명 또는 검은색 측면의 96웰 또는 384웰 투명 바닥 마이크로플레이트를 사용하여 수행할 수 있습니다. 본 실험에서는 Corning 96웰 플레이트(제품 번호 3595)를 사용했습니다.


아니요. Incucyte® Caspase 3/7 및 Annexin V 염료는 Incucyte® 시스템을 이용한 생세포 이미징을 위해 특별히 제조되었습니다. 혼합 후 바로 판독할 수 있으며, 세척이나 고정 과정은 필요하지 않습니다.


네. Incucyte® Annexin V 또는 Caspase-3/7 염료를 Incucyte® 생세포 분석 시스템과 함께 사용할 때 특수 분석 배지 또는 완충액을 사용할 필요가 없습니다. Incucyte®에 내장된 이미지 분석 도구를 사용하면 사용된 배지, 시약 또는 검사 물질에서 발생할 수 있는 배경 형광을 최소화할 수 있습니다. 단, Annexin V가 세포 외부에 노출된 포스파티딜세린에 결합하는 것은 Ca2+에 의존적이므로 분석 배지의 Ca2+ 농도가 1 mM 이상인지 확인하십시오.


Incucyte® Caspase3/7 염료를 사용할 때는 세포 사멸 세포 수를 세는 것을 권장합니다. Caspase-3/7 염료는 세포 사멸 세포의 핵을 염색하므로 인접한 세포 사멸 세포의 핵을 쉽게 구별할 수 있습니다. 그러나 Incucyte® Annexin V 염료는 세포 표면 전체를 염색합니다. 따라서 인접한 세포를 구별하기 어려울 수 있습니다. Annexin V 염료를 사용할 때는 전체 형광 영역을 정량화하는 것이 더 정확한 방법입니다.


네, 세포 사멸 측정값은 라벨이 없는 Incucyte® 세포 밀집도 측정값으로 정규화할 수 있습니다. 일부 처리로 인해 세포 파편화가 심하거나 세포 위상차가 크게 변할 수 있지만, Incucyte® 위상차 밀집도 지표는 분석 과정 동안 총 세포 수를 유용한 추정치로 나타내는 것으로 확인되었습니다.

세포 사멸 분석 종료 시점에 DNA를 포함하는 객체의 총 개수로 정규화하는 것도 가능합니다. 이를 위해 Vybrant® DyeCycle™ Green Stain(ThermoFisher) 사용을 권장합니다. 이 염색 시약은 세포 사멸 시약이 포함된 배지를 흡입하거나 세척할 필요 없이 분석 웰에 직접 첨가할 수 있습니다.