Incucyte 세포자멸사 분석을 통한 생세포 분석

더 알아보기: 세포자멸사의 동역학적 정량화

자가사멸 분석

세포 사멸은 정상적인 조직 발달과 항상성을 위해 세포가 시기적절하게 프로그래밍된 세포 사멸을 겪는 필수적인 과정입니다. 세포 사멸 신호의 이상은 암, 자가면역질환, 신경퇴행성 질환을 포함한 다양한 인간 병리학과 연관되어 있습니다. 대부분의 경우 세포 사멸 유도는 카스파아제(시스테인 아스파르테이트 단백질분해효소) 활성화와 세포막 변화로 이어집니다. 카스파아제-3 또는 카스파아제-7의 활성화는 세포의 불가역적인 세포 사멸 약속을 초래하며 세포 사멸의 신뢰할 수 있는 지표로 간주됩니다. 세포막 인지질 인 포스파티딜세린(PS)의 대칭성 조절된 상실도 세포 사멸의 전형적인 지표입니다. 죽어가는 세포는 정상적으로 안쪽을 향하던 PS를 세포 표면으로 이동시켜 주변 식세포에 의한 죽어가는 세포의 조기 인식을 허용합니다.

수많은 효소적, 판독기 및 유세포 분석 검사가 카스파아제-3/7 활성화 또는 PS 외재화를 측정하기 위해 설계되었습니다. 대부분의 카스파아제-3/7 검사는 효소에 의해 인식되는 DEVD(아스파르트산-글루타메이트-발린-아스파르트산) 펩타이드 모티브를 포함하는 루시퍼라아제, 비색 또는 형광 시약 기질을 포함합니다. 아넥신 V는 PS 잔기에 대해 높은 친화력과 선택성을 가진 재조합 단백질로, 세포 사멸 감지에 사용될 수 있습니다. 형광 탐침에 결합된 아넥신 V를 사용한 세포 사멸 검사는 PS 외재화 감지를 위해 최적화되었으며 대개 유세포 분석으로 측정됩니다. 일반적인 세포 사멸 검사의 주요 단점은 다음과 같습니다:

  • 단일 (임의) 사용자 정의 종료 지점 측정을 산출함
  • 죽어가는 세포 손실 또는 PS 비대칭성 손실을 초래할 수 있는 여러 세척 단계 또는 세포 분리가 필요함
  • 시간이 지남에 따라 증가하는 신호 배경으로 인해 장기 측정에 적합하지 않습니다.

Incucyte® 생세포 분석 시스템은 믹스 앤 리드 Incucyte® 및 를 사용하여 여러 세포자멸 경로를 동시에 실시간으로 측정하는 실시간 자동화된 세포자멸 분석을 가능하게 합니다.


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Incucyte® 세포자멸사 분석의 주요 장점

Incucyte® 세포자멸사 간행물 보기
Real-time visualization of HT-1080 Cells with Caspase 3/7 data figure
Real-time visualization of HT-1080 Cells with Caspase 3/7 data figure
세포자멸사를 타임랩스 이미징으로 시각화하고 정량화

시간에 따른 세포자멸사를 관찰하고 직관적인 Incucyte® 이미지 분석 도구를 사용하여 세포자멸사 세포를 정량화합니다. 형태학적 변화를 시각화하고 이미지와 동영상으로 처리 효과를 검증합니다.


아래 예시 데이터 참조
   

배양기 내부의 세포 자멸사 시간 경과를 자동으로 분석

세포를 안정적인 배양기 환경에서 제거하지 않고 치료 효과가 언제 어떻게 발생했는지 확인 - 장기 연구(0~10일 이상)에 이상적

간단한 혼합 및 판독 96/384 웰 프로토콜

Incucyte® 카스파제-3/7 또는 Incucyte® 애녹신 V 염료와 함께 플레이트 세포에 처리를 추가하고 Incucyte® 생세포 분석 시스템에서 동적으로 판독하세요. 세포 세척, 고정 또는 들어올리기 불필요

두 가지 다른 경로를 통해 세포 사멸 감지 및 확인

세포 사멸 메커니즘을 확인하기 위해 Incucyte® 카스파제-3/7 및 애녹신 V 염료를 다중 분석

증식 및 세포독성 측정과 다중 분석

Incucyte® 세포자멸사 분석법을 Incucyte® Nuclight 시약 또는 세포독성 염료와 결합하여 증식/세포독성의 다중 측정을 수행하세요. 세포독성 및 세포정지 처리 효과를 쉽게 구별할 수 있습니다.

세포자멸사 분석법을 위한 예시 데이터

시간경과 이미징을 사용하여 세포자멸사 시각화 및 정량화

그림 1. Incucyte® 세포 사멸 분석 및 이미지 분석 도구를 사용하여 선택한 세포의 세포 사멸 정량화.

  • 캄프토테신(100 µM) 존재 하에서 HT-1080 육종 세포의 Incucyte® 이미지 및 Incucyte® Caspase-3/7 녹색 염료. Caspase-3/7 형광 녹색 신호와 동반되는 특징적인 세포 수축 및 막 돌출에 주목하세요.
  • Incucyte® 이미지 분석 도구는 세포 사멸 종양 세포(분홍색 마스크)의 자동 계수를 가능하게 합니다.
  • TNFα와 사이클로헥시미드로 처리된 MDA-MB-231 유방 선암세포의 Incucyte® 이미지, Incucyte® Caspase-3/7 레드 염료 존재 하에서.
  • Incucyte® 이미지 분석 도구는 자동화된 세포자멸 종양세포 계산(연한 파란색 마스크)을 가능하게 합니다.
  • Incucyte® 캄프토테신(1 µM) 존재 하에서의 줄기 T 림프구 세포 이미지와 Incucyte® Annexin V 레드 염료.
  • 자동화된 이미지 분석(파란색 마스크)은 세포자멸 면역 세포의 직접적인 감지를 가능하게 합니다.
  • 글루타메이트(300 µM) 존재 하에 별아교세포와 공동 배양된 원발성 쥐 전뇌 신경세포의 Incucyte® 이미지와 Incucyte® Annexin V 녹색 염료. 신경세포는 Incucyte® Neurolight Red 렌티바이러스로 선택적으로 표지되었습니다.
  • 분석된 이미지(파란색 마스크)는 세포자멸사 세포를 양성으로 표시합니다.

인큐베이터 내부의 세포 사멸 과정을 자동으로 분석

. 인큐사이트® 세포 사멸 분석 키트를 통해 96/384 웰 플레이트의 모든 웰을 자동으로 이미징하고 분석하여 시간에 따른 세포 사멸을 마이크로플레이트로 측정할 수 있습니다. 시간 경과에 따른 분석으로 농도 의존적 처리 효과를 확인할 수 있습니다. 데이터를 농도-반응 곡선으로 변환하여 약리학적 특성을 비교할 수 있습니다. 모든 시점의 이미지로 정량화를 검증하세요.

간단한 혼합 및 판독 96/384 웰 프로토콜 - 세척, 고정, 들어올림 없음

. 중간/고처리량 스크리닝을 위해 한 번에 최대 6개의 384웰 플레이트 판독 가능

두 가지 다른 경로를 통해 세포 자살(아포토시스) 감지 및 확인

카스파제-3/7과 애녹신 V 신호를 배양 시료에서 동시에 감지하고, 세포 자살의 시간 경과를 자동으로 결정하세요.

증식 및 세포독성 측정의 다중 분석

. 캄프토테신(1 µM) 또는 사이클로헥시미드(1 µM)로 처리된 HT-1080 섬유육종 세포를 Incucyte® Annexin V 녹색 염료와 함께 24시간 후 세포 사멸 검출(사멸 세포 마스킹 표시). 녹색(세포 사멸) 집단을 식별하는 분류 플롯(두 번째 열), 시간 경과 플롯(세 번째 열) 및 농도-반응 곡선(네 번째 열)은 세포독성 및 정적 화합물의 효과 차이를 보여줍니다.

세포 사멸 분석을 위한 솔루션

인큐사이트 세포 사멸 분석 개요

인큐사이트 실시간 세포 분석 시스템은 조직 배양 배양기 내에서 실시간, 자동화된 세포 사멸 분석을 가능하게 합니다. 혼합 및 판독 인큐사이트 카스파아제-3/7 및 아넥신 V 염료를 사용하여 여러 세포 사멸 경로를 동시에 실시간으로 측정할 수 있습니다. 세포 사멸 신호를 인큐사이트 고해상도 위상차 이미지와 상관시켜 추가적인 생물학적 통찰력과 세포 사멸 사망의 형태학적 검증을 제공합니다 (예: 세포 수축, 막 돌출, 핵 응축).

  • 인큐사이트 카스파아제-3/7 염료는 비활성, 비형광성(DEVD) 기질로, 세포막을 자유롭게 통과하여 활성화된 카스파아제-3/7에 의해 절단되어 녹색 또는 적색 DNA 결합 형광 라벨을 방출할 수 있습니다. 세포 사멸 세포는 형광 표지된 핵의 출현으로 식별됩니다.
  • Incucyte® 아넥신 V 염료는 매우 밝고 광안정성이 높은 CF 염료로 표지되어 있으며, 세포자멸사 세포의 노출된 PS에 결합할 때 녹색, 적색, 주황색 또는 근적외선 형광 신호를 방출합니다.

Incucyte® 세포자멸사 분석을 사용하여 종양, 면역 또는 신경 배양에서 세포자멸사를 측정하세요.

TNFα와 사이클로헥시미드로 처리된 Incucyte® Nuclight Green 표지 MDA-MB-231 인간 유방 선암 세포(왼쪽)와 캄프토테신으로 처리된 Jurkat T 림프구 세포(오른쪽)에서 세포자멸사의 실시간 검출. 세포자멸사 세포는 mix-and-read Incucyte® Caspase-3/7 적색 염료 또는 아넥신 V 적색 염료를 사용하여 적색으로 표지됩니다. 세포자멸사 세포는 Incucyte® 생세포 분석 시스템을 사용하여 실시간으로 정량화됩니다.

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Incucyte® 생세포 분석 기기

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세포자멸사(아포토시스) 분석 기술 자료

주요 자료

응용 노트

Incucyte® 세포자멸사 분석을 통한 세포자멸사의 동적 정량화

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백서

면역 세포 살해 분석의 진화: 생세포 분석 활용

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라이브-세포 분석 6판 핸드북

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제품 리소스

Brochure: Incucyte® — Reagents, Consumables and Software
브로셔

Incucyte® — 시약, 소모품 및 소프트웨어

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Incucyte® 생세포 분석 시스템 시약 및 소모품

PDF | 136.2 KB
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제품 가이드: Incucyte® Annexin V 염료

PDF | 792.6 KB
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Incucyte Caspase-3/7 Dyes product guide cover

제품 가이드: 인쿠사이트 케스파제-3/7 염료

PDF | 1.9 MB
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14,000개 이상의 인쿠사이트 출판물

Incucyte®는 생명과학 연구에 대한 새로운 연구 영역을 탐색하고 질문에 답하는 데 도움을 줍니다.

간행물 탐색

세포자멸사 분석 자주 묻는 질문

네, 원칙적으로 그렇습니다. Incucyte® Caspase-3/7 및 Annexin V 프로토콜은 다양한 부착성 및 비부착성 세포주를 사용하여 최적화되었으므로 암세포, 면역세포, 신경세포를 포함한 모든 세포 유형에 적용할 수 있어야 합니다. 일부 세포 유형은 Caspase-3 발현이 부족할 수 있음을 참고하십시오(예: MCF-7 세포). 이러한 세포 유형의 경우 Incucyte® Caspase-3/7 염료 대신 Incucyte® Annexin V 염료를 사용하여 세포자멸사를 측정하는 것이 좋습니다.


네. 여기 설명된 프로토콜과 데이터는 Jurkat 인간 T 림프구 세포와 같은 부유 세포주에서 세포자멸사를 정량화할 수 있음을 보여줍니다. 부유 세포가 시야에 머물도록 플레이트에 코팅할 수 있습니다. Poly-L-ornithine, poly-D-lysine 또는 Matrigel™과 같은 코팅이 잘 작동하는 것으로 나타났습니다.


예. 형광 색소가 Incucyte® 생세포 분석 시스템과 호환되고 Incucyte® Caspase3/7 또는 Annexin V 염료에서 방출되는 형광 신호를 방해하지 않는 한 가능합니다.


예. 여기에 설명된 프로토콜과 데이터는 단일 웰에서 두 가지 세포사멸 마커(예: caspase-3/7 활성화 및 포스파티딜세린 외재화)를 정량화할 수 있음을 보여줍니다. 예를 들어, 이를 위해 Incucyte® Annexin V Red 염료(카탈로그 번호 4641)와 녹색 Incucyte® Caspase-3/7 염료(카탈로그 번호 4440)를 이중화하는 것을 권장할 수 있습니다.


예. Incucyte® Caspase-3/7 염료 또는 Incucyte® Annexin 염료를 다른 색상의 Incucyte® Cytotox 염료와 다중화하여 다른 세포 사멸 판독값을 평가할 수 있습니다.


예. Incucyte® Annexin V 적색 염료(카탈로그 번호 4641)를 프로피디움 요오드화물과 이중화할 수 있습니다. Incucyte® 생세포 분석 시스템의 적색 채널을 사용하여 프로피디움 요오드화물 신호를 정량화하고, 녹색에서 적색로 80%의 분광 혼합 매개변수를 설정하는 것을 권장합니다(자세한 내용은 형광 염료 최적화 기술 노트를 참조하십시오).


데이터는 10X 및 20X 대물렌즈로 생성되었지만, 이 분석법은 4X 대물렌즈와도 호환됩니다. 10X 대물렌즈는 더 넓은 시야를 제공하고 웰당 필요한 이미지 수를 줄여줍니다. 더 높은 공간 해상도를 위해서는 20X 대물렌즈가 권장됩니다.


Incucyte® 세포자멸사 분석은 Incucyte® 생세포 분석 시스템에서 지원되는 투명한 측면 또는 검은색 측면의 96 또는 384웰 투명 바닥 마이크로 티터 플레이트를 사용하여 수행할 수 있습니다. 여기에 설명된 실험에서는 Corning 96웰 플레이트(Cat # 3595)를 사용했습니다.


아니오. Incucyte® Caspase 3/7 및 Annexin V 염료는 Incucyte® 시스템을 위한 생세포 이미징에 특별히 제조되었습니다. 간단히 혼합하여 읽으면 됩니다. 세척이나 고정이 필요하지 않습니다.


예. Incucyte® Annexin V 또는 Caspase-3/7 염료를 Incucyte® 생세포 분석 시스템과 함께 사용할 때 특수 검사 배지나 완충액을 사용할 필요가 없습니다. 통합된 Incucyte® 이미지 분석 도구를 통해 배지, 시약 또는 테스트 에이전트에서 발생할 수 있는 배경 형광을 최소화할 수 있습니다. 단, Annexin V의 외재화된 인지질세린 결합은 Ca2+ 의존적이므로 검사 배지의 Ca2+ 농도가 ≥1 mM임을 확인하십시오.


Incucyte® Caspase3/7 염료를 사용할 때 세포 사멸 세포를 계산하는 것을 권장합니다. Caspase-3/7 염료는 세포 사멸 세포의 핵을 염색하므로 인접한 세포 사멸 세포의 개별적으로 표시된 핵을 쉽게 구분할 수 있습니다. 그러나 Incucyte® Annexin V 염료는 전체 세포 표면에 표지됩니다. 따라서 인접한 세포를 구분하기 어려울 수 있습니다. Annexin V 염료를 사용할 때는 총 형광 영역을 정량화하는 것이 더 견고한 접근 방식이라고 권장합니다.


예, 세포 사멸 측정은 레이블 없는 Incucyte® 세포 밀집도 측정으로 정규화할 수 있습니다. 일부 처리로 인해 상당한 세포 파편화 또는 상당한 위상차 변화가 발생할 수 있지만, Incucyte® 위상차 밀집도 메트릭이 검정 과정 전체에 걸쳐 총 세포 수의 유용한 추정치임을 발견했습니다.

또한 세포 사멸 검정 종료 시 DNA를 포함하는 총 객체 수로 정규화하는 것도 가능합니다. 이 목적으로 Vybrant® DyeCycle™ Green 염료(ThermoFisher)를 사용하는 것을 권장합니다. 염료는 세포 사멸 시약이 포함된 배지를 흡입하거나 세척하지 않고 직접 검정 웰에 추가할 수 있습니다.


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