ATP 분석

다양한 세포 유형에서 세포질 ATP를 직접 측정하기 위해 Incucyte^® CytoATP 렌티바이러스 시약을 발현하십시오.

HeLa 세포에 Incucyte^® CytoATP 렌티바이러스를 감염시키고 퓨로마이신 선택 과정을 거쳐 안정적으로 CytoATP를 발현하는 세포 집단을 얻었다. CytoATP를 발현하는 세포의 형태(A)와 증식(B)은 모세포와 비교했을 때 변화가 없었다. (C) 96웰 마이크로플레이트에 웰당 4,000개의 세포를 접종한 CytoATP를 안정적으로 발현하는 HeLa 세포에 2-데옥시-D-글루코스(2DG)와 시안화칼륨(KCN)을 함께 처리하였다. 3시간 동안 촬영한 CytoATP 형광 이미지를 정량 분석한 결과, 해당 과정과 산화적 인산화가 동시에 억제됨에 따라 ATP가 농도 의존적으로 빠르게 고갈되는 것을 확인하였다.

세포 유형별 세포질 ATP 변화를 자동으로 측정하고 시각화하여 역동적인 종양 환경에 대한 심층적인 이해를 제공합니다.

삼중 음성 유방암(TNBC) 세포주인 HCC1806과 수용체 양성 유방암 세포주인 MCF7에 CytoATP 또는 CytoATP 비결합 대조군을 안정적으로 발현시켜 CCD14086SK 섬유아세포(8,000개 세포/웰)의 존재 또는 부재 하에 배양하였다. 세포 내 ATP 변화(색상 스케일 마스킹)는 Incucyte^® ATP 분석 소프트웨어 모듈을 사용하여 분석하였다. 마스킹된 이미지(A)는 단일 배양 및 CCD14086SK 세포와의 공동 배양에서 1 µM CB-839로 처리한 HCC1806 세포의 ATP 변화를 시각화한 것이다. 운동학적 데이터는 단일 배양된 MCF-7(수용체 양성 세포주)(C)에 비해 CB-839 처리 후 TNBC 세포주(B)에서 ATP 고갈이 더 지속적으로 나타남을 보여준다. 그러나 기질세포와의 공동배양은 TNBC 세포에서 CB-839에 대한 내성을 매개했지만, 수용체 양성 세포주는 차별적인 효과를 나타내지 않았습니다. IC50 곡선은 72시간(B) 및 15시간(C) 시점의 데이터를 나타냅니다.

치료에 대한 반응으로 나타나는 단기 및 장기 ATP 역학에 대한 더 깊은 생물학적 통찰력을 얻기 위해 실시간 대사 데이터를 생성합니다.

CytoATP 또는 비결합 대조군을 안정적으로 발현하는 NIH 3T3 세포를 표준 조건(포도당) 또는 포도당 대신 갈락토스를 함유한 배양 배지(갈락토스)에서 배양하여 산화적 인산화를 통한 에너지 대사 의존성을 유도했습니다. 96웰 마이크로플레이트에 웰당 12,000개의 세포를 접종하고 형광 이미지(10배 확대)를 촬영한 후, 무독성(암브리센탄), 세포독성(클로르프로마진) 또는 미토콘드리아 독성(네파조돈) 화합물을 처리했습니다. 동역학 데이터는 세포독성 또는 미토콘드리아 독성 화합물을 처리한 세포에서 ATP가 빠르게 고갈됨을 보여줍니다. 세포독성 화합물에 대한 반응은 두 배지 조건에서 유사했지만, 갈락토스 배지에서 배양한 세포에서 네파조돈의 IC50 값이 왼쪽으로 이동하는 것은 미토콘드리아 독성을 시사합니다. 초기 시점에서 더 뚜렷한 분리가 관찰되었으며, 이는 동역학 CytoATP 데이터가 화합물 프로파일 평가에 추가적인 통찰력을 제공할 수 있음을 보여줍니다.

세포 형태 변화와 ATP 대사 사이의 연관성을 밝혀내어 세포 행동의 유익한 시간적 변화를 규명한다.

CytoATP 또는 비결합 대조군을 안정적으로 발현하는 HeLa 세포를 96웰 마이크로플레이트에 웰당 2,000~8,000개씩 접종하고, ATP를 고갈시키는 화합물인 클로르프로마진(60 µM), 에토포사이드(100 µM), 또는 2DG(20 mM) + KCN(2 mM)으로 처리하였다. 이러한 화합물들은 동역학 분석(삽입 그림)을 통해 각 화합물의 효과 발현 시간을 다양하게 나타냈다. ATP 고갈 과정 동안 촬영한 세포의 HD 위상차 이미지(10배율)는 클로르프로마진(21시간)과 에토포사이드(75시간)로 처리한 세포에서 형태학적 변화가 극적으로 나타나는 반면, 2DG + KCN(60분)으로 처리한 세포는 대조군과 비교했을 때 형태학적 변화가 거의 나타나지 않았음을 보여준다.

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