실험설계법(DOE)과 자동화된 생물반응기를 활용한 고수율 AAV 생산 플랫폼 개발

재조합 아데노 관련 바이러스 벡터(AAV)는 상대적인 안전성, 광범위한 친화성, 그리고 지속적인 유전자 발현 특성으로 인해 임상 유전자 치료에 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 규제 승인 및 임상 시험이 지속적으로 확대됨에 따라, 증가하는 수요를 충족하기 위해서는 확장 가능하고 비용 효율적인 제조 방법이 필수적입니다. 본 연구에서는 실험 설계(DOE) 방법론과 자동화된 일회용 마이크로 생물반응기를 통합하여 Expi293F HEK 293 부유 세포에서 AAV2 생산 수율을 최적화하는 견고하고 처리량이 높은 생산 플랫폼을 개발했습니다. 삼중 플라스미드 형질전환 시스템을 사용하여 Sartorius Ambr^® 15 마이크로 생물반응기 시스템에서 pH, 배양 배지, 공급 전략, 교반 속도, 형질전환 세포 밀도, 플라스미드 DNA 투입량, FectoVIR^®-AAV 대 DNA 비율, 플라스미드 화학양론을 포함한 주요 공정 변수를 체계적으로 변화시키면서 5번의 다인자 실험을 수행했습니다. 동시에, 바이러스 입자 패키징 효율을 향상시키도록 설계된 새로운 헬퍼 플라스미드인 pPLUS^® AAV-Helper를 구현했습니다. 공정 성능은 정량적 및 디지털 PCR 방법을 통한 벡터 게놈 역가, ELISA를 통한 총 캡시드 입자 농도, 질량 광도계를 통한 완전 캡시드 비율 측정, 그리고 세포 생존율 및 성장 동역학을 통해 평가했습니다. Sartorius MODDE^® Pro 소프트웨어를 사용한 DOE 분석을 통해 형질전환 시약 비율과 세포 밀도 간의 중요한 상호작용을 밝혀냈고, 최적 작동 범위를 확인하여 최대 8.8x10¹¹ vg/mL의 역가를 달성했습니다. 이는 기준 조건 대비 70배 향상된 결과이며, 동시에 약 25%의 양호한 완전 캡시드 비율을 얻었습니다. 확장성을 입증하기 위해 최적화된 조건을 UniVessel^® 2L SU 생물반응기 시스템에 적용했습니다. 세 차례의 실험에서 얻은 예비 규모 확대 결과는 유사한 생산성과 제품 품질을 보여주며, Ambr^® 15에서 도출된 규모 축소 모델의 견고성을 확인시켜 줍니다. 이 접근 방식은 여러 변수를 동시에 풍부한 데이터로 스크리닝할 수 있도록 하여 공정 개발을 가속화할 뿐만 아니라, 기존의 진탕 플라스크 워크플로우에 대한 의존도를 줄여 상당한 시간과 자원을 절약할 수 있게 해줍니다. 본 연구 결과는 실험 설계(DOE) 전략과 자동화된 일회용 생물반응기를 결합하여 전임상 및 임상 공급에 적합한 확장 가능하고 수율이 높은 AAV 제조 플랫폼을 구축하는 데 유용함을 강조합니다.