실시간 라이브 세포 분석을 통한 대식세포 기능 이해

불멸화된 THP-1 세포와 혈액 유래 일차 단핵구의 분화 동안 형태학적 변화를 모니터링합니다.  THP-1 세포는 48시간 동안 5ng/mL PMA에 세포를 노출시켜 M0 대식세포로 분화되었습니다. 1차 단핵구는 50ng/mL GM-CSF에서 6일 동안 배양한 후 1ng/mL LPS + 20ng/mL IFN-γ에서 하루 더 배양하여 M1 유사 표현형으로 분화하거나, 50ng/mL M-CSF에서 6일 동안 배양한 후 20ng/mL IL-4에서 하루 더 배양하여 M2 유사 표현형으로 분화했습니다. 형태는 이전 연구 결과(Young et al, J Immunol, 1990)와 일치합니다. M1 개체군은 달걀 프라이 형태를 갖고 있는 반면, M2 개체군은 달걀 프라이와 스핀들 모양의 세포가 혼합된 개체군을 가지고 있습니다.

단계 이미지는 큰 소포를 포함하는 최종적으로 분화된 인간 iPSC 유래 대식세포를 생성하는 분화 인간 iPSC 유래 단핵구(0-7일)의 형태를 보여줍니다. 최소 7일 동안 유지 배지에 100ng/mL M-CSF를 추가하여 분화를 달성했습니다.

THP-1 단핵구를 CD11b, CD14 또는 CD40과 복합체화된 Incucyte^® Fabflur-488 항체의 존재 하에 배지(미분화), 비타민 D3 또는 PMA에 노출시켰습니다. PMA는 배지 단독 또는 비타민 D3 처리된 세포와 비교하여 세포 형태(HD 위상차 영상)에서 현저한 변화를 보여주었습니다. 동역학 그래프는 다양한 처리에 대한 반응으로 차등적이고 시간에 따른 표면 단백질 발현을 강조합니다.

나이브 또는 PMA로 분화된 M0인 THP-1 세포를 피브로넥틴으로 코팅된 ClearView 주화성 막에 접종했습니다. 그런 다음 세포를 C5a 구배에 노출시키고 Incucyte 시스템을 사용하여 매시간 이미지를 획득했습니다. 약리학적 반응의 분석은 t=30시간에 수행되었습니다. 분화된 대식세포 유사 THP-1 세포는 C5a에 대해 강한 농도 의존적 ​​반응을 보인 반면, 분화 전에 THP-1 세포에서는 반응이 거의 또는 전혀 관찰되지 않았습니다.

일차 혈액 단핵구는 M2 유사 표현형으로 분화되었습니다. 6일 동안 50ng/mL M-CSF를 투여한 후 추가 하루 동안 20ng/mL IL-4를 투여합니다. Matrigel로 코팅된 ClearView 주화성 막에 대식세포를 뿌린 후 C5a 구배에 노출시키고 Incucyte 시스템을 사용하여 2시간마다 이미지를 획득했습니다. 바닥면 상 분석을 수행하고 4.5시간 및 11시간에 약리학적 반응을 측정했습니다. 더 높은 농도에서 반응 지연으로 인해 상당한 시간 의존적 C5a 효능 변화가 있음을 주목하십시오. 이는 호중구가 사용된 경우 관찰되지 않았기 때문에 특정 반응입니다.

iPSC 유래 대식세포(Axol Bioscience)는 시간 및 세포 수에 따라 Incucyte^® pHrodo^® Green E. coli Bioparticles^®를 삼킵니다.  pHrodo^® Green E. coli Bioparticles^®가 100ug/well 존재하는 경우 iPSC 유래 대식세포의 위상차 및 형광 혼합 이미지는 시간 경과에 따른 Bioparticles^®의 흡수를 보여줍니다.  각각 아래에는 식세포작용 역학을 완전히 정량화하기 위한 분할 사용을 강조하는 해당 마스크 이미지가 있습니다.  단일 pHrodo^® Green E. coli 생체 입자 양(100ug/well)을 사용한 iPSC 유래 대식세포 식균작용의 시간 경과는 세포 수 의존성을 보여줍니다.

증가하는 농도의 항-CD47 항체(B6H12.2)로 처리되고 인간 골수 유래 대식세포(BMDM; 표시된 값은 평균 ± SEM, n=4)에 첨가된 표지된 CCRF-CEM 세포.

J774.A1 대식세포 내부에 휩싸인 Jurkat 세포는 세포 식균작용의 양에 비례하여 높은 형광 강도를 나타냅니다. 신속한 이미징과 2분 간격을 사용하여 개별 삼킴 이벤트를 보여주는 동영상을 만들 수 있습니다.

THP-1 세포는 세포를 24시간 동안 200 nM PMA, 24시간 동안 200 nM PMA + 20 ng/mL IFNγ + 1 μg/mL LPS, 또는 24시간 동안 200 nM PMA + 20 ng/mL IL-4에 각각 노출시킴으로써 M0, M1 또는 M2 대식세포로 분화되었습니다. 그런 다음 세포를 pHrodo red로 표지된 세포사멸 Jurkat와 공동 배양하고, 분화된 대식세포의 식세포 능력을 삼켜진 Jurkat의 형광 신호로 평가했습니다. 데이터에 따르면 M0 및 M2로 분화된 THP-1 세포는 모두 M2 대식세포의 항염증 기능과 일치하는 상당히 높은 식세포 능력을 가지고 있습니다.