Incucyte^® 및 iQue^® 분석을 통한 동적 T 세포 기능 정량화

(1) 작은 세포독성 T 세포와 더 큰 표지 종양 세포(빨간색) 사이의 물리적 접촉. T 림프구 분열. (2) 세포독성 T 림프구의 공격을 받는 종양 세포: "죽음의 키스". (3) 종양 세포 세포질 과립화 직후 카스파제 3/7 표지(녹색), 핵 응축 및 세포 사멸이 이어집니다. (4) 종양세포 유사분열: 하나의 세포가 두 개가 된다.

사용자 친화적인 Incucyte^® 소프트웨어를 사용하면 세포사멸 종양 세포(녹색 물체, 노란색 윤곽선)를 이미지 기반으로 직접 검출하고 실시간 종양 세포(Incucyte^® NucLight 빨간색 표지 핵, 파란색 윤곽선)를 계산할 수 있습니다. 운동학적 판독은 치료 효과의 시간 의존성을 나타냅니다.

. SKOV-3 NucLight Green 세포를 PMBCS로 제거하고 CD3/CD28 Dynabeads로 활성화했습니다. (a) Incucyte로 분석한 표적 세포 수 시간 경과. (B) IFNγ 및 (C) TNFα에 대한 시간적 사이토카인 데이터는 하루에 10μl의 상등액 샘플을 사용하여 TCA 키트의 Qbead 구성요소(Qbeads 또는 Assay Builder: IFNγ, 옵션 1 및 TNFα 옵션 2)를 사용하여 정량화했습니다. / (D) 표적 세포 수(Incucyte) 및 사이토카인(iQue3)의 시간 경과에 따른 AUC에 대한 농도 반응 곡선.

. Ramos NucLight Green 세포에 PBMC를 접종하고 BiTE 항체(항-hCD3xCD19) 또는 대조 항체(항-hCD3xβGAL)로 활성화했습니다. (A) 대조군 또는 (B) BiTE 항체가 있는 경우 72시간의 대표적인 이미지. Incucyte^® 시간 경과 데이터(3시간마다 이미지)는 표적 세포의 세포 수량(C) 및 클러스터링(E)을 추적했습니다. 밝기와 크기(GCU x μm2)를 모두 설명하는 녹색 적분 강도 측정법의 배수 변화를 사용하여 표적 세포를 정량화했습니다. 대조군 항체와 비교하여 BiTE 항체의 존재 하에서 표적 세포 사멸(D) 및 클러스터링(F)에 대한 72시간에서의 농도-반응 곡선.

핵 제한 RFP를 안정적으로 발현하는 A549 종양 세포를 둥근 바닥 ULA 96웰 플레이트에 시딩하고 3일 동안 회전타원체를 형성하도록 허용했습니다. 일단 형성되면, 회전 타원체는 항-CD3 및 IL-2 항체 칵테일의 존재 또는 부재 하에서 새로 분리된 PBMC와 공동 배양되었습니다. Incucyte^® HD 위상 및 형광 이미지는 항CD3 및 IL-2 항체가 없을 때(비활성화, 상단 패널) 및 존재(활성화, 하단 패널)에서 회전타원체 증식에 대한 PBMC의 효과를 비교합니다. 활성화된 PBMC가 있는 경우 회전 타원체의 형광 강도가 현저하게 손실됩니다. 시간 경과 플롯은 시간 경과에 따른 형광 강도의 손실로 정량화된 구형 세포독성을 보여줍니다. 데이터는 6시간 간격으로 7일 동안 수집되었습니다. 각 데이터 포인트는 평균 ± SEM, n=3 웰을 나타냅니다.

CD3/CD28 Dynabead 활성화 1차 T 세포를 피브로넥틴에서 배양된 HUVEC 단층에 시딩하고 Incucyte^® 시스템을 사용하여 매분 이미지를 획득했습니다. 노란색과 주황색 화살표는 HUVEC 세포 사이를 이동하고 결국 ClearView 삽입물의 모공(파란색 원) 아래로 이동하는 백혈구를 나타냅니다.

CD3/CD28 Dynabead 활성화된 1차 T 세포를 피브로넥틴에서 배양된 HUVEC 단층에 접종했습니다. T 세포:HUVEC 단층 공동 배양물을 함유하는 삽입물은 표시된 농도에서 CXCL12 구배에 노출되었습니다. Incucyte^® ZOOM을 사용하여 30분마다 이미지를 획득하고 위상 분석을 수행했습니다. 약리학적 반응의 분석은 t=6시간에 수행되었다. 각 데이터 포인트는 평균 ± SEM, n=4를 나타냅니다.