Incucyte^® 및 iQue^® 분석을 통한 동적 T-세포 기능 정량화

(1) 작은 세포독성 T 세포와 더 큰 표지된 종양 세포(빨간색) 사이의 물리적 접촉. T 림프구 분열. (2) 세포독성 T 림프구의 공격을 받는 종양 세포: '죽음의 키스'. (3) 카스파제 3/7 표지(녹색)가 즉시 뒤따르는 종양 세포 세포질 과립화, 핵 응축 및 세포 사멸. (4) 종양 세포 분열: 한 세포가 두 개로 나뉨.

사용자 친화적인 Incucyte 소프트웨어는 세포자멸 종양 세포(노란색 윤곽의 녹색 객체)를 직접 이미지 기반으로 감지하고 생존 종양 세포(Incucyte NucLight 빨간색 표지된 핵, 파란색 윤곽)를 실시간으로 계산할 수 있게 합니다. 동역학적 판독값은 치료 효과의 시간 의존성을 보여줍니다.

. SKOV-3 NucLight Green 세포를 PMBCS로 제초하고 CD3/CD28 Dynabeads로 활성화했습니다. (a) Incucyte로 분석한 표적 세포 수 시간 경과. (B) IFNγ 및 (C) TNFα의 시간별 사이토카인 데이터는 상층액 샘플 10µl/일만 사용하여 TCA 키트의 Qbead 구성 요소(Qbeads 또는 Assay Builder: IFNγ, 옵션 1 및 TNFα 옵션 2)로 정량화했습니다. (D) 표적 세포 수(Incucyte) 및 사이토카인(iQue3)의 시간 경과에 대한 AUC의 농도 반응 곡선.

. 라모스 NucLight 그린 세포에 PBMCs를 파종하고 BiTE 항체(항-hCD3xCD19) 또는 대조 항체(항-hCD3xβGAL)로 활성화했습니다. (A) 대조군 또는 (B) BiTE 항체 존재 하에 72시간의 대표 이미지. Incucyte^® 시간 경과 데이터(3시간마다 이미지)는 표적 세포의 세포 수(C)와 클러스터링(E)을 추적했습니다. 밝기와 크기를 모두 고려하는 녹색 통합 강도 지표의 배율 변화(GCU x μm2)를 사용하여 표적 세포를 정량화했습니다. BiTE 항체와 대조 항체 존재 하에 72시간에서의 표적 세포 사멸(D)과 클러스터링(F)에 대한 농도-반응 곡선.

핵 제한 RFP를 안정적으로 발현하는 A549 종양 세포를 둥근 바닥 ULA 96-웰 플레이트에 파종하고 3일 동안 스페로이드를 형성하도록 했습니다. 형성된 후, 스페로이드를 항-CD3 및 IL-2 항체 칵테일의 존재 또는 부재 하에 신선하게 분리된 PBMC와 공동 배양했습니다. Incucyte^® HD 위상 및 형광 이미지는 항-CD3 및 IL-2 항체가 없는 경우(비활성화, 상단 패널) 및 존재하는 경우(활성화, 하단 패널)의 PBMC가 스페로이드 증식에 미치는 영향을 비교합니다. 활성화된 PBMC 존재 시 스페로이드의 현저한 형광 강도 감소를 참고하세요. 시간 경과 그래프는 형광 강도 손실로 정량화된 스페로이드 세포독성을 보여줍니다. 데이터는 6시간 간격으로 7일 동안 수집되었습니다. 각 데이터 포인트는 평균 ± SEM, n=3 웰을 나타냅니다.

CD3/CD28 Dynabead로 활성화된 1차 T 세포를 섬유결합단백질 위에 배양된 HUVEC 단층에 파종하고, Incucyte^® 시스템을 사용하여 매분 이미지를 획득했습니다. 노란색과 주황색 화살표는 HUVEC 세포 사이로 이동하고 결국 ClearView 삽입물의 구멍(파란색 원)을 따라 내려가는 백혈구를 나타냅니다.

CD3/CD28 다이나비드로 활성화된 일차 T세포를 피브로넥틴 위에 배양된 HUVEC 단일층에 파종했습니다. 삽입된 T세포__PH_0__ 단일층 공동 배양물을 지정된 농도의 CXCL12 농도 구배에 노출시켰습니다. 이미지는 Incucyte^® ZOOM을 사용하여 30분마다 획득되었으며, 위상 분석이 수행되었습니다. 약리학적 반응 분석은 t=6시간에 수행되었습니다. 각 데이터 포인트는 평균 ± 표준오차를 나타내며, n=4입니다.