혼합 림프구 반응(MLR)

단일 웰에서 다중 면역표현형 분석 및 효과기 사이토카인 농도 측정

그림 2. 단일 웰에서 체크포인트 억제제 약물에 의해 유도된 사이토카인 방출 및 마커 발현 측정

수지상세포(DC)를 해동하고 IL-4, 그랜자임 B, LPS를 첨가하여 하룻밤 동안 활성화시킨 후 96웰 플레이트에 웰당 40,000개씩 분주했습니다. B/Green 인코딩 염료로 표지된 CD4+ T 세포를 DC 대비 3:1 비율로 첨가했습니다. T 세포 활성화를 촉진하기 위해 다양한 농도의 면역관문 억제제인 펨브롤리주맙(항-PD-1 단클론항체)을 첨가했습니다. 사이토카인 샘플은 2일차와 6일차에 분석했습니다. 마커 발현은 분석 종료 시점(6일차)에 분석했습니다. iQue^® 인간 T 세포 활성화 키트와 iQue^® 3 HTS 플랫폼을 사용하여 IFNγ 분비, TNFα 분비 및 CD25 발현을 분석했습니다.

약리학적 분석에 적합한 T 세포 반응 측정값을 생성합니다.

그림 3. iQue Forecyt^®를 이용한 자동 EC 계산으로 약물 유도 T 세포 반응 정량화

DC 세포(웰당 40,000개)에 CD4+ T 세포(T 세포 대 DC 비율 3:1)를 접종하고 펨브롤리주맙으로 처리했습니다. 2일차와 6일차에 10 µL 샘플을 iQue Qbeads^® Human Inflammation Panel Kit를 사용하여 분석했습니다. 히트맵은 웰당 IL-2(pg/mL) 방출량을 보여줍니다. 대조군 웰에는 약물이 없는 T 세포와 DC 세포가 포함되었습니다. 곡선은 시간 경과 및 펨브롤리주맙 농도에 따른 염증성 사이토카인의 방출을 나타냅니다. 2일차에 펨브롤리주맙에 대한 IL-2 방출의 EC 값은 0.53 µg/mL였으며, 6일차에는 모든 IL-2 생성이 중단되었습니다. IL-6, CCL2 및 CCL3 수치는 모두 2일차에서 6일차로 증가했으며, 6일차의 CCL2 및 CCL3 방출에 대한 EC 값은 각각 0.98 µg/mL 및 1.0 µg/mL로 매우 유사했습니다.

96웰 또는 384웰 플레이트에서 마커 및 사이토카인을 신속하게 정량화하여 스크리닝 및 프로파일링 연구를 용이하게 합니다.

그림 4. 384웰 분석 형식을 사용하여 여러 PBMC 공여자 쌍에 걸쳐 체크포인트 억제제가 사이토카인 방출에 미치는 영향을 신속하게 분석합니다. 

여러 공여자로부터 얻은 PBMC(80,000개/웰)를 단독(단일 공여자 대조군) 또는 조합(총 8쌍의 공여자)으로 배양했습니다. 세포에 다양한 농도의 항-CTLA4 면역관문 억제제 항체를 처리했습니다. PHA와 MMC를 혼합한 PBMC를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용했습니다. 3일 후, IFNγ iQue Qbeads^®를 사용하여 사이토카인 농도를 분석하고 표준 곡선을 이용하여 농도를 계산했습니다. 히트맵은 PBMC 공여자 쌍 간의 항-CTLA4 유도 IFNγ 방출량 차이를 보여줍니다. 막대 그래프는 혼합 PBMC가 단일 공여자 대조군보다 지속적으로 더 많은 IFNγ를 방출함을 보여줍니다. 이는 17 ng/mL의 항-CTLA4를 첨가했을 때 더욱 증가했습니다. 공여자 쌍 7의 항-CTLA4(EC = 6.5 ng/mL)에 대한 반응을 보여주는 대표적인 농도 반응 곡선입니다.

실시간 데이터 분석 및 혁신적인 시각화 도구를 활용하여 답변 시간을 단축하세요.

그림 5. iQue Forecyt^®를 이용한 사전 설정 게이팅 및 자동 데이터 분석은 T 세포 활성화에 대한 즉각적인 판독값을 제공합니다. 

서로 다른 두 명의 공여자로부터 얻은 CD4+ T 세포를 한 명의 공여자로부터 얻은 수지상 세포(DC)와 다양한 T:DC 비율로 각각 공동 배양했습니다. 각 T 세포 공여자는 DC 공여자의 HLA 대립유전자와 서로 다른 정도의 불일치를 보였습니다. 공여자 1의 T 세포는 DC 공여자의 HLA 프로필과 더 유사했으며, 8개의 대립유전자 중 3개(HLA-A, -B, -C, -DR 각각 2개씩)만 불일치한 반면, 공여자 2의 T 세포는 8개의 대립유전자 중 7개가 불일치했습니다. 대조군으로는 T 세포를 단독으로 배양한 경우(음성)와 Dynabeads 또는 Immunocult와 함께 배양한 경우(양성)를 사용했습니다. 분석은 iQue^® Human T Cell Activation Kit를 사용하여 수행했습니다. 플레이트 이미지는 CD4+ 세포 집단 내 CD25 발현의 차이를 웰별로 보여줍니다. T 세포 활성화는 T:DC 비율이 감소함에 따라 증가하며, 공여자 2의 T 세포에서 더 크게 나타났습니다. 이는 HLA 대립유전자 불일치가 '비자기' 세포 인식을 촉진하기 때문에 예상되는 결과입니다. 등고선 도표는 기증자 1과 기증자 2(T:DC 비율 3:1)의 CD25 양성 T 세포 비율을 보여줍니다. 막대 그래프는 CD4+ 세포 집단에서 CD25 양성 세포의 비율을 정량화한 것입니다.