T 세포 살해 - 세포 및 사이토카인 프로파일링

새로운 치료용 항체를 발견하거나, 특정 체크포인트 억제제를 개발하거나, CAR T-세포 기능을 평가하는 경우, 연구를 앞으로 진행하는 핵심은 생물학적으로 관련성 있고, 재현 가능하며, 비용 효율적인 방식으로 더 많은 샘플을 신속하게 평가할 수 있는 능력에 달려 있습니다.

iQue^® HTS 플랫폼은 고정된 넓은 동적 범위를 활용하여 표현형과 분비된 사이토카인의 기능적 분석을 동시에 수집할 수 있으며, 서로 다른 시점의 불일치나 후속 분석을 위해 샘플을 분할할 필요성을 제거합니다.

iQue^® HTS 플랫폼 살펴보기

CD8+ T 세포의 상태는 활성화 마커 CD25와 피로 마커 PD-1의 발현을 프로파일링할 수 있습니다. 2개의 효과 사이토카인(IFNγ와 Granzyme B)은 동일한 웰에서 샌드위치 면역측정법 형식의 2-플렉스 Qbeads를 사용하여 정량됩니다. T 세포 증식 또는 인코딩된 표적 세포의 동시 측정이 가능하지만, 이 그림에는 포함되어 있지 않습니다.

그림 1. iQue^® 인간 T 세포 살해 키트 분석 원리 설명.

Incucyte^® Nuclight Green으로 표지된 Ramos 세포를 PBMCs와 공동 배양 분석에서 (15K/well) 파종했습니다. CD3xCD19 BiTE 항체로 활성화를 유도했습니다. 세포를 분쇄하기 전에 세포와 상층액을 iQue^® Human T Cell Killing Kit를 사용하여 분석했습니다. 표적 생존율은 6일 시간 경과 동안 농도 의존적으로 감소합니다. CD8+ 세포의 T 세포 활성화 및 피로 마커 발현은 3일까지 증가하다가 이후 감소하기 시작합니다. IFNγ 및 Granzyme B 방출.

그림 2. CD3xCD19 이중특이성 T세포 유도체(BiTE) 항체가 농도 의존적 세포 사멸, 마커 발현 및 6일간의 사이토카인 방출을 유발함.

Incucyte^® Nuclight Green 표지된 Ramos 세포를 PBMCs와 공동 배양 분석에서 (15K/well) 파종했습니다. 활성화는 Immunocult CD3/CD28/CD2에 의해 유도되었으며, 사용된 최고 농도는 권장 자극(25 µL per 1e6 cells/mL)과 동등합니다. 세포를 분쇄한 후 세포와 상층액 샘플을 채취하여 iQue^® Human T Cell Killing Kit를 사용하여 분석했습니다. CD8+ 세포의 후기(CD25) T 세포 활성화 발현. CD8+ 세포의 (PD-1) T 세포 피로 발현. (C) IFNγ 및 Granzyme B 방출.

그림 3. Immunocult CD3/CD28/CD2 활성화제가 T 세포 활성화, 피로 및 살해 마커에 농도와 시간에 따른 변화를 유발함.

세 명의 서로 다른 공여자로부터 얻은 PBMCs(120K/well)를 Incucyte^® Nuclight Green 표지된 Ramos 세포(40K/well)와 공동 배양하고 Dynabeads CD3/CD28의 다양한 밀도로 활성화했습니다. 3일째 iQue^® Human T Cell Killing Kit를 사용하여 분석을 수행했습니다. 오버레이 플롯은 양성(4:1 Dynabead to PBMC 비율) 및 음성(Dynabeads 없음) 대조군 간의 CD25 발현 차이를 보여줍니다. 열 지도는 Dynabeads에 대한 응답으로 각 공여자의 PBMCs에서 CD25 발현을 보여줍니다. 공여자 2는 1 및 3 공여자와 비교하여 낮은 Dynabead 밀도에서 향상된 민감도를 보였습니다. 데이터는 농도-반응 곡선으로 요약되었습니다.

그림 4. iQue Forecyt^®의 사전 결정된 게이트는 T 세포 하위 집단의 자동 표현형 분석을 가능하게 합니다

단일 웰에서 세포 마커 발현 데이터와 상층액 사이토카인 농도를 혼합 세포 및 비드 기반 분석으로 획득합니다. 이 간소화된 워크플로우는 추가 최적화나 희석이 필요 없으며 단 하나의 세척 단계만 포함하여 결과 도출 시간을 최소화합니다.

그림 5. iQue^® 인간 T 세포 킬링 키트를 사용한 T 세포 표현형 및 사이토카인 방출 분석을 위한 쉬운 프로토콜.