종양 침윤 림프구: 왜 연구하는가?

종양 침윤 림프구를 Incucyte^® 생세포 분석 시스템과 iQue^® HTS 세포 분석 플랫폼을 모두 사용하여 분석할 수 있는 프로토콜의 개요

• 자극에 대한 면역 세포 침윤 정량화
• 종양 미세환경의 효과를 확인하기 위해 침윤된 세포와 비침윤 세포의 활성화 프로파일 간 표현형 차이를 밝힌다.

그림 2. (A) 유방암 구상체로 CD3+ PBMC 침윤의 농도 의존적 증가. 

BT474(웰당 4,000개 세포) 구상체는 72시간 동안 형성된 후 PBMC(웰당 20,000개 세포)와 CD3/CD28 다이나비즈가 추가되었다. CD3/CD28 다이나비즈를 이용한 PBMC 활성화는 CD3 T-세포가 농도 의존적으로 유방암 구상체로 침윤되도록 한다. 비즈의 최고 밀도(20K)에서 PBMC는 종양 구상체를 죽이기 시작하여 구상체가 공격됨에 따라 침윤이 감소한다. 각 데이터 포인트는 평균 ±SEM을 나타내며, n=8이다.

비침윤 세포는 수집되어 표지되었다. 구상체는 이후 분해되고 침윤된 세포가 표지되었다. 침윤된 세포는 CD69(초기), CD25(중기), HLA-DR(후기) 활성화 마커의 훨씬 더 높은 수준을 표현한다. 각 데이터 포인트는 평균 ±SEM을 나타내며, 8개의 반복 실험이 수행되었다.

그림 3. T-세포의 종양 구상체 침윤은 세포 유형에 특이적이며 간질 세포에 의해 조절된다. 

A549, SKOV-3 또는 BT474(웰당 5,000개 세포) 스페로이드는 72시간 동안 형성된 후, 사전 활성화된(CD3/CD28 다이나비즈) PBMC(웰당 25,000개 세포)가 추가되었습니다. 데이터는 암 유형당 3명의 공여자를 나타냅니다. CD3 침윤은 암 유형에 따라 달라집니다. CD8__PH_0__ 비율 또한 암 유형에 따라 다르며, 이는 치료 결과와 병리학적 완전 반응(pCR)의 가능성을 나타내는 지표입니다. BT474를 단독으로 또는 CCD1068SK 섬유아세포와 1:1로 혼합하여 72시간 동안 스페로이드를 형성한 후 사전 활성화된 PBMC와 함께 파종했습니다. 섬유아세포의 포함은 CD3+ 세포의 스페로이드 침윤을 실질적으로 감소시킵니다(>60%).

여러 플레이트의 데이터를 병렬로 획득하고 분석하여 더 빠르게 답변 얻기

그림 4. 통합된 iQue Forecyt^® 소프트웨어는 빠른 분석을 가능하게 하여 데이터 처리 시간 단축. 

TCA 키트에는 미리 정의된 게이팅 템플릿이 있어 '설정 후 그대로 두기' 경험을 제공합니다. 게이팅은 양성(녹색) 및 음성(빨간색) 집단을 정의하여 조정할 수 있으며, 이는 자동으로 플레이트 보기 판독값을 업데이트합니다. 그런 다음 플레이트 보기를 간단한 마법사를 통해 농도 반응 곡선으로 변환할 수 있습니다.

빠른 샘플링 속도를 통해 높은 생물학적 가변성과 관련된 문제를 완화하기 위해 반복 횟수를 늘릴 수 있습니다.

그림 5. CD3 세포 침윤은 생물학적 변수 효과를 연구하기 위해 구형체 분해 후 iQue^® HTS 플랫폼을 사용하여 정량화되었습니다.. 

iQue^®의 고처리량 능력을 활용하면 획득 시간을 연장하지 않고도 반복 횟수를 늘릴 수 있어, 다양한 생물학적 효과를 연구할 수 있습니다.

96-웰 플레이트:

• 4 반복 (4번마다 세척, 4번마다 흔들기, 5초 흡입) 21분 32초
• 8회 반복 (8번마다 세척, 4번마다 흔들기, 5초 간격 흡입) 19분 08초