종양 미세환경을 재현하기 위한 다중 구형체 분석법

플레이트 리더 분석법이나 기존 영상 시스템과 같은 전통적인 방법은 형태학적 통찰력 부족, 실시간 데이터 부족, 영상 촬영 중 환경적 교란 등으로 인해 3D 스캐폴드 기반 다중 종양 구형체의 효과적인 분석에 어려움을 겪습니다.

주요 제한 사항:

• 영상 촬영 간격 사이에 불완전한 데이터와 누락된 정보가 있습니다.
• 배양액을 배양기 밖으로 옮길 때 발생하는 환경적 변동
• 시간 소모적인 설정 및 이미지 최적화
• 전문가 수준의 사용자가 필요한 복잡한 이미지 분석

해결책:

Incucyte^® CX3 라이브 셀 분석 시스템은 스피닝 디스크 공초점 이미징 기능을 통해 연구자들이 배양 조건에 최소한의 변화만 주면서 다중 스페로이드의 선명하고 역동적인 3D 이미지를 획득할 수 있도록 지원하여, 시간에 따른 더욱 풍부하고 일관된 분석을 가능하게 합니다. Incucyte^® 3D 다중 스페로이드 분석법은 배양기 내에서 직접 스페로이드 형성, 성장 및 생존력을 실시간으로 모니터링하는 과정을 더욱 간소화하고 자동화합니다. 이 분석법은 매립된 스페로이드 또는 Matrigel^® 층 위에 플레이팅된 스페로이드를 사용할 수 있습니다. 명시야 이미징의 경우, 이 분석법은 Incucyte^® SX1, S3 및 SX5 시스템과 완벽하게 호환됩니다. Incucyte^® 3D 다중 스페로이드 분석법은 실시간 모니터링을 위한 간소화되고 자동화된 솔루션을 제공합니다.

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• 실험실에서 검증된 프로토콜, 고품질 이미지 및 편향되지 않은 분석을 통해 약리학적 분석에 적합한 신뢰할 수 있는 데이터를 제공합니다.
• 배양기 내부에서 Matrigel^® 위에 또는 그 안에 내장된 3D 다중 종양 구형체 배양의 성장량을 정량화하고 형태를 조사하십시오.
• 비간섭성 시약을 사용하여 실시간 다중 생존력 및 독성 측정으로 작용 메커니즘을 조사합니다.
• 종양 미세환경을 재현하고 시간에 따른 세포 변화를 조사하기 위해 추가적인 세포 유형을 통합합니다.

실험실에서 검증된 프로토콜, 고품질 이미지 및 편향되지 않은 분석을 통해 약리학적 분석에 적합한 신뢰할 수 있는 데이터를 제공합니다.

Incucyte^®의 실험실에서 검증된 다중 구형체 프로토콜은 3D 세포 배양 기술의 문제 해결에 소요되는 시간을 줄이고 정량적 분석에 적합한 이미지를 얻기 위해 시행착오를 거칠 필요성을 없애줍니다.

배양기 내에서 방해받지 않고 Matrigel^® 위에 또는 그 안에 내장된 3D 다중 종양 구형체 배양의 라벨 없는 성장 및 형태학적 특성을 조사하십시오.

MCF-7 및 MDA-MB-231 세포를 웰당 1,000개씩 접종하고 Matrigel^® 층 위에 또는 Matrigel^®를 기저층에 삽입하여 3일 동안 다중 구형체를 형성하도록 했습니다. 시간 경과에 따른 구형체 성장 모니터링 영상(형성 후 0~7일)을 통해 원형(MCF-7) 및 별 모양(MDA-MB-231) 다중 구형체 간의 형태학적 차이를 확인했습니다.

MCF-7 및 MDA-MB-231 세포를 평평한 바닥의 96웰 플레이트에 Matrigel^®(웰당 1,000개 세포)를 깔고 배양한 후, 캄토테신(CMP)과 세포 사멸 시각화를 위한 Incucyte^® Annexin V Orange Dye로 처리하였다. 분할된(노란색 윤곽선) 명시야 이미지와 위상차 + 주황색 형광 이미지를 시간 경과 그래프와 함께 분석하여 세포 유형별 성장 양상을 확인하고, CMP가 스페로이드 성장을 억제하는 효과를 나타낸다.

비파괴적 시약을 사용하여 실시간 다중 생존력 및 독성 측정으로 작용 메커니즘을 조사합니다.

MCF7-Green Nuclight 세포(웰당 1,000개 세포)를 Incucyte^® Annexin V Orange Dye(1%) 존재 하에 접종하고 3일 동안 스페로이드를 형성하도록 했습니다. 스페로이드에 다양한 농도의 캄토테신(CMP) 또는 시스플라틴(CIS)을 처리하고 추가로 7일 동안 이미지를 촬영했습니다. (A) 처리 6일 후의 명시야(BF, 위쪽 행), Incucyte^® Nuclight Green(녹색 형광, 중간 행) 및 Incucyte^® Annexin Orange Dye(주황색 형광, 아래쪽 행) 이미지를 비교했습니다. (B) CMP 및 CIS 처리된 스페로이드 모두에서 성장이 억제되고(명시야 면적 시간 경과) 평균 주황색 형광 강도가 증가하는 것이 관찰되었습니다. 치료 후 4일째부터 CMP와 CIS EC50은 농도에 따라 생존력이 감소하고 세포 사멸이 증가하는 것을 보여줍니다.

MCF-7-Nuclight 적색 다중 구형체는 알려진 세포독성 화합물로 7일간 처리하기 3일 전에 형성되었습니다. 시간 경과에 따른 플레이트 관찰을 통해 구형체 크기(총 BF 면적)와 생존율(BF 경계 내 적색 형광 강도)에 대한 처리 효과를 신속하게 시각화할 수 있습니다. 농도 반응 곡선은 처리 후 0~7일 동안의 시간 경과 데이터에 대한 곡선 아래 면적(AUC) 분석 결과를 나타냅니다. 모든 화합물은 농도 의존적으로 성장과 생존율을 억제했으며, 효능 순서는 CMP > CHX > OXA였습니다.

MDA-MB-231-Green Nuclight 스페로이드를 Incucyte^® Annexin V Orange Dye(1%) 존재 하에 다양한 화합물로 처리하여 세포독성 효과를 시각화했습니다. 회전 디스크 공초점 현미경이 장착된 Incucyte CX3를 사용하여 촬영한 일련의 비디오는 다양한 약물 화합물 처리에 대한 동적인 세포 반응을 보여줍니다. 공초점 이미징 기술은 살아있는 세포 내에서 발생하는 형태학적 및 표현형적 변화에 대한 고해상도 정보를 제공하여 시간에 따른 약물 효능 및 세포 행동에 대한 포괄적인 관점을 제시합니다.

생물학적으로 의미 있는 공동 배양 실험을 수행하세요

종양 미세환경을 재현하고 시간에 따른 세포 변화를 조사하기 위해 추가적인 세포 유형을 포함시키십시오.

(A) MDA-MB-231 세포를 Matrigel^®를 기반으로 하는 평평한 바닥의 96웰 플레이트에 단독 배양 또는 NHDF와 공동 배양(1:1 비율, 각 웰당 1,000개 세포)하여 3일 동안 다중 스페로이드를 형성하도록 했습니다. Incucyte^® DF-Brightfield(DF-BF) 이미지를 통해 3일 동안의 단독 배양 및 공동 배양 조건을 비교했습니다(세포 파종 후 6일). 스페로이드 형태에 대한 NHDF의 시간적 영향을 주목하십시오. (B) 세포질에 제한된 GFP를 안정적으로 발현하는 BT474 세포를 Matrigel^®를 기반으로 웰당 1,000개 세포씩 파종하고 3일 동안 다중 스페로이드를 형성하도록 한 후, 새로 분리한 PBMC(E:T, 5:1)와 허셉틴을 첨가했습니다. Incucyte^® DF-BF 및 형광 이미지(7일)는 PBMC가 없을 때(상단 패널)와 있을 때(하단 패널) Herceptin이 스페로이드 증식에 미치는 영향을 비교합니다(노란색은 명시야 윤곽 마스크로 표시). PBMC가 존재할 때 형광 강도가 감소하는 것을 확인할 수 있습니다. 시간 경과에 따른 녹색 형광 감소는 Herceptin 농도에 따라 나타나며, 이는 생존 가능한 표적 세포의 감소를 나타냅니다. Herceptin에 대한 농도 반응 곡선은 HER2 양성 및 HER2 음성 다중 스페로이드(각각 BT-474 대 MCF7) 간의 민감도 차이를 보여줍니다.