보체 의존성 세포독성(CDC) 분석을 위한 고처리량 세포계측법

그림 2. 96웰 또는 384웰 포맷에서 CDC 활성에 대한 단클론항체를 효율적으로 스크리닝하는 방법

Ramos 세포(웰당 5,000개)를 다양한 농도(3회 반복, 항체당 12가지 농도, 표 1 참조)의 항-CD20 항체와 함께 15분간 배양한 후, 15% 인간 혈청을 첨가하여 30분간 추가 배양하여 CDC를 유도했습니다. 이후 세포를 세척하고 iQue^® 세포막 무결성(R/Red) 염색 시약으로 염색했습니다. 히트맵은 웰당 생존 Ramos 세포의 비율을 나타냅니다(밝은 회색일수록 생존 세포 비율이 낮음).

리툭시맙과 트룩시마를 가열하면 CDC 유도가 크게 감소했으며, 가열된 항체의 EC 값은 최대값보다 컸습니다. 반면, 비치료용 항-CD20 항체는 가열에 대한 저항성이 더 강하여 열처리 후 EC 값이 2배 감소했습니다. 비푸코실화된 형태의 비치료용 항-CD20 항체는 원래 항체보다 증가된 CDC 활성을 보였습니다.

그림 3. 단일 배양웰 내 여러 세포 유형에 걸친 CDC 활성 비교

세 가지 부유 세포 유형의 CD20 발현을 분석했습니다. Ramos 세포에서 발현이 가장 높았고, Rajis 세포가 그 뒤를 이었으며, Jurkat 세포는 CD20 음성으로 IgG 배경 대조군과 유사한 발현을 보였습니다.

Raji 세포(iQue^® 세포 증식 및 인코딩(V/Blue) 염료로 밝게 표지됨), Ramos 세포(인코딩 염료로 희미하게 표지됨) 및 Jurkat 세포(표지되지 않음)를 CDC 분석을 위해 웰당 5K개씩 혼합하고 히스토그램에 표시된 바와 같이 인코딩 염료의 형광 강도를 기준으로 분리했습니다.

리툭시맙(항-CD20-IgG1)에 의한 CDC 유도는 세포 유형에 따라 다양했으며 CD20 발현과 상관관계가 있었습니다. 예를 들어, 라모스 세포는 CD20 발현 수준이 가장 높았고 리툭시맙에 의한 CDC에 가장 민감했습니다.

그림 4. 부유 세포 모델과 부착 세포 모델을 모두 사용하여 다양한 단일클론항체(mAb)로 CDC 활성을 측정합니다.

비부착성 세포(CD20 양성 Ramos 세포 및 CD20 음성 Jurkat 세포) 또는 부착성 세포(Her2 양성 AU565 세포 또는 Her2 음성 MDA-MB-468 세포)를 CDC 분석에 함께 사용했습니다. 두 경우 모두 항원 음성 세포 유형에 iQue^® 세포 증식 및 인코딩(V/Blue) 염료를 사용하여 각 웰에서 두 세포 유형을 구별할 수 있도록 했습니다(그래프 참조).

항-CD20 단클론항체(리툭시맙, 트룩시마, 비치료용 항-CD20)는 항원 양성 세포 유형 특이적인 보체 의존성 세포 활성화(CDC) 증가를 유도했습니다. 항-HER2 항체(트라스투주맙, 카드시라, 페르투주맙)는 CDC에 아무런 영향을 미치지 않았습니다. 부착 세포에 대한 CDC 활성이 부족한 것은 부착 세포 유형에서 보체 조절 표지자(예: CD46, CD55, CD59)의 발현이 증가했기 때문일 가능성이 높습니다.

그림 5. 새로운 데이터 시각화 기능을 갖춘 iQue Forecyt^® 소프트웨어를 사용하여 여러 혈청 공여자의 CDC 활동을 비교합니다.

리툭시맙에 의한 CDC 유도를 4명의 서로 다른 인간 혈청 공여자로부터 비교했습니다. 공여자 1~3의 경우 CDC는 유사했으며, EC 값은 0.29~0.36 µg/mL 범위였습니다. 공여자 4의 혈청이 존재할 경우 CDC는 약간 감소했으며, 리툭시맙의 EC 값은 0.53 µg/mL로 측정되었습니다.