보체 의존성 세포독성(CDC) 분석을 위한 고처리량 세포 분석

그림 2. 96 또는 384-웰 형식에서 CDC 활성에 대한 mAb 효율적 스크리닝

Ramos 세포(5K/well)를 15분 동안 항-CD20 항체(표 1에 나열)의 다양한 농도(3반복, mAb당 12농도)와 함께 배양한 후, CDC를 유도하기 위해 15% 인간 혈청을 30분 동안 추가했습니다. 세포를 세척하고 iQue^® 세포 막 무결성(R/Red) 염료로 표지한 후, 히트맵은 웰당 생존 Ramos 세포의 % (연한 회색 = 생존 세포 비율이 낮음)를 나타냅니다.

Rituximab과 Truxima를 가열하면 CDC 유도에 큰 감소가 발생하여, 가열된 mAb에 대한 EC₅₀ > 최대값을 보였습니다. 비교적, 비치료용 항-CD20은 열 처리 후 EC₅₀이 2배 감소하며 가열에 더 저항적이었습니다. 비치료용 항-CD20의 비후코실화 형태는 원래 항체보다 증가된 CDC 활성을 보였습니다.

그림 3. 단일 웰에서 여러 세포 유형의 CDC 활성 비교

세 가지 부유 세포 유형의 CD20 발현을 프로파일링했습니다. Ramos의 발현이 가장 높았고, 그 다음으로 Rajis였으며, Jurkat은 CD20 음성으로 IgG 배경 대조군과 유사한 발현을 보였습니다.

Raji 세포(iQue^® 세포 증식 및 인코딩(V/Blue) 염료로 밝게 표지됨), Ramos 세포(인코딩 염료로 희미하게 표지됨) 및 Jurkat 세포(미표지)를 CDC 분석을 위해 결합(5K/well)하고, 히스토그램에 표시된 대로 인코더 염료 형광에 따라 분리했습니다.

Rituximab(항-CD20-IgG1)에 의한 CDC 유도는 세포 유형에 따라 다양했으며 CD20 발현과 상관관계가 있었습니다. 예를 들어 Ramos는 가장 높은 수준의 CD20를 발현했으며 Rituximab에 의한 CDC에 가장 민감했습니다.

그림 4. 부유 및 부착 세포 모델을 사용하여 다양한 단클론 항체의 CDC 활성 측정

비부착성 세포(CD20 양성 라모스 및 CD20 음성 주르캇) 또는 부착성 세포(Her2 양성 AU565 또는 Her2 음성 MDA-MB-468)를 CDC 분석에 결합했습니다. 두 경우 모두 항원 음성 세포 유형에 iQue^® 세포 증식 및 인코딩(V/블루) 염료를 표지하여 각 웰에서 두 세포 유형을 구별할 수 있도록 했습니다(도표에 표시됨).

항-CD20 mAbs (리투시맙, 트룩시마, 비치료용 항-CD20)는 항원 양성 세포 유형별 CDC 증가를 유도했습니다. 항-Her2 항체(트라스투주맙, 카드실라, 퍼투주맙) 중 어느 것도 CDC에 영향을 미치지 않았습니다. 부착 세포에 대한 CDC 활성 부족은 부착 세포 유형의 보체 조절 마커(예: CD46, CD55 및 CD59) 발현 증가로 인한 것으로 보입니다.

그림 5. iQue Forecyt^® 소프트웨어의 새로운 데이터 시각화 기능을 사용하여 여러 혈청 공여자 간 CDC 활동 비교

리투시맙에 의한 CDC를 4명의 서로 다른 인간 혈청 공여자에서 비교했습니다. CDC는 공여자 1-3에서 비교 가능했으며, EC₅₀ 값은 0.29에서 0.36 µg/mL 범위였습니다. 공여자 4 혈청 존재 시 CDC는 약간 감소했으며, 리투시맙에 대한 EC₅₀ 값은 0.53 µg/mL로 측정되었습니다.