미생물 오염물질

생물학적 제제 또는 바이러스 백신의 생산 공정 전반에 걸쳐 무균 검사를 실시하고 그 결과를 입증해야 합니다.

싸토리우스는 GMP 규정에 따라 직접 접종법과 막 여과법을 이용한 무균 시험을 제공하며, 유럽 약전(EP), 일본 약전(JP), 미국 약전(USP)의 기준을 준수합니다.

시험에 앞서, 시료 매트릭스가 분석법에 의해 검증되어 저해 효과가 있는지 확인해야 합니다. 이는 대표적인 시험 미생물을 낮은 농도로 시험 물질에 첨가하고 적절한 성장을 관찰함으로써 이루어집니다.

다음 생물들은 모델 생물로 적합합니다:

호기성 박테리아

• 황색포도상구균
• 바실러스 서브틸리스
• 녹농균

혐기성 박테리아

• 클로스트리디움 스포로게네스

균류

• 칸디다 알비칸스
• 아스페르길루스 브라질리엔시스

직접 무균 시험에서는 시료를 두 가지 다른 배양 배지, 즉 유동 티오글리콜레이트 배지와 대두 카제인 소화액에 접종합니다. 막 여과 시험에서는 시료를 0.45 µM 필터로 여과한 후 트립티카제 대두 배지(TSB)와 유동 티오글리콜레이트 배지에 접종합니다. 두 가지 방법 모두 14일 동안 배양합니다. 싸토리우스는 최종 관찰 후 5일 이내에 분석 증명서와 함께 시험 결과를 제공할 수 있습니다.

다만, 이러한 무균 시험은 무균 상태를 의도하지 않은 제품에는 적용할 수 없으며, 그러한 경우에는 미생물 오염도 시험을 사용해야 한다는 점에 유의해야 합니다.

싸토리우스는 귀사의 재료에 적합한 시험 방법은 물론, 시료 수와 부피에 대해서도 조언해 드릴 수 있습니다.

전문가 상담 요청

미생물 오염도 시험의 목적은 호기성 조건에서 생장할 수 있는 중온성 세균과 곰팡이의 수를 측정하는 것입니다. 이 시험은 주로 물질이나 제제가 확립된 미생물학적 품질 규격을 충족하는지 여부를 확인하기 위해 고안되었습니다. 무균 시험과 유사하지만, 시료가 추가 가공을 거치므로 무균 상태가 요구되지 않는 경우에 수행됩니다. 따라서 이 시험은 일반적으로 고객이 자체 공정에 대한 허용 가능한 미생물 오염도 한도를 설정한 원료 및 가공 중 시료(예: 대량 수확물)에 사용됩니다. (무균 상태가 예상되는 대량 수확물 시료의 경우 무균 시험을 수행할 수도 있습니다. 미생물 오염도 시험 또는 무균 시험 중 어떤 시험을 사용할지는 개발자의 재량에 달려 있습니다.)

미생물 오염도 검사에는 평판 배양법과 막 여과법 두 가지 방법이 있습니다. 두 방법 모두 규제 기관에서 인정하는 방법이며, 개발자의 재량에 따라 사용할 수 있습니다. 평판 배양법은 일반적으로 많은 양의 시료를 처리할 때 사용됩니다. 항생제와 같은 특정 물질의 저해 효과가 관찰될 경우에는 막 여과법을 사용할 수 있습니다.

평판 계수법에서는 시험 물질을 완충수에 10배 희석한 후, 미리 정해진 양을 2개의 TSA 배지와 2개의 SDA 배지에 도말합니다. 이후 배양하여 평균 CFU/mL 값을 기록합니다.

싸토리우스는 귀사의 재료에 적합한 시험 및 시험 방법에 대해 조언해 드릴 수 있습니다.

전문가 상담 요청

임상 연구용 생물학적 제제 및 인체 사용 허가 제품에 있어 마이코플라스마 검출 및 제거는 매우 중요합니다. 이 미생물군은 성장 조건이 다양하고 까다로운 경우가 많아 검사가 복잡합니다. 싸토리우스는 cGMP 기준과 국제 의약품 규제 조화 위원회(ICH), 유럽 약전(EP), 미국 약전(USP)의 최신 지침을 준수하는 마이코플라스마 검사 서비스를 제공합니다.

EP에 기술된 마이코플라스마 검사에는 전통적인 두 가지 구성 요소가 있습니다. 하나는 한천 및 액체 배지법이고, 다른 하나는 시험관 내 지표 세포 배양법입니다. 검사 대상 시료는 검사 전에 검사법에서 적격성 평가를 받아야 합니다. 적격성 평가는 검사 대상 물질에 낮은 농도의 검사 대상 미생물을 첨가하고 검출 여부를 확인하는 과정을 포함합니다.

다음 생물들은 실험 생물로 적합합니다:

• A. 레이드라위
• M. gallisepticum
• M. fermentans
• M. hyorhinis
• M. 구강
• 폐렴구균

한천과 배지

한천 및 액체배지법에서는 검체를 다양한 액체 및 고체 배지에 접종한 후, 각각 다른 환경 조건(호기성 및 혐기성)에서 배양합니다. 배양 기간 동안 접종된 액체배지에서 검체를 채취하여 한천 배지에 접종합니다. 콜로니가 관찰되면 양성으로 판정하며, 전체 검사 기간은 28일입니다.

지표 세포 배양

지표 세포 배양법은 시료를 적절한 세포 기질(3T3 마우스 또는 Vero 세포)에 접종하고 배양한 후 DNA에 결합하는 형광 염료로 염색하는 방법입니다. 배양된 세포를 광학 현미경으로 관찰하여 지표 세포의 핵 주변에 나타나는 형광 반점 또는 과립을 확인하는데, 이는 마이코플라스마의 존재를 나타냅니다. 싸토리우스는 최종 관찰 후 5일 이내에 분석 증명서와 함께 검사 결과를 제공할 수 있습니다.

신속 마이코플라스마 중합효소 연쇄 반응(PCR)

유럽 약전(EP)은 기존의 한천 배지 및 액체 배지법 외에도 적절한 검증을 거친 PCR 기반 마이코플라스마 검사를 인정하고 있습니다. 이는 2012년부터 생물약품 승인 기준에 PCR 기반 마이코플라스마 검출법 사용을 허용한 미국 식품의약국(FDA)의 뒤를 이은 것입니다. 이 검사를 통해 제조업체는 최대 28일이 소요되는 기존 방법을 신속한 기술로 대체할 수 있습니다. 싸토리우스(Sartorius)에서 마이코플라스마 PCR 검사를 수행할 수 있으며, 시료 접수 후 48시간 이내에 결과를 확인할 수 있습니다.

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이 검사는 특정 미생물에 감수성이 있는 인간 또는 영장류 세포주를 검사할 때 수행됩니다. 샘플을 두 종류의 선택 배지(한천 배지)와 한 종류의 액체 배지에 접종합니다. 배지는 36~38°C에서 56일 동안 배양한 후 미코박테리아의 존재 여부를 관찰합니다.

시험의 유효성을 검증하기 위해, 양성 대조군을 첨가한 대조군을 포함시켜 시험 물질에 양성 대조군을 처리함으로써 미코박테리아 증식 억제 여부를 확인합니다.

이 방법은 유럽 약전 2.6.2항을 준수합니다.

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엔도톡신 검사는 일반적으로 최종 의약품에만 실시됩니다. 엔도톡신은 그람 음성 세균의 세포벽 외막 구성 성분으로, 생물약품 생산 과정에서 세포 배양을 오염시키거나 최종 치료제를 오염시킬 가능성이 있습니다.

탁도 측정 검사는 대서양 투구게의 혈액 세포(아메바 세포) 수용액 추출물인 리물루스 아메바 세포 용해물(LAL)을 액체 시료 또는 표준 내독소 희석액에 첨가하여 수행합니다. 그런 다음 반응 혼합물의 탁도를 측정합니다. 내독소 농도가 높을수록 응고 효소가 더 빠르게 활성화되어 시료의 탁도가 높아집니다. 동역학적 분석법이므로 각 시료가 특정 광학 밀도(OD)에 도달하는 시간이 중요한 측정값입니다.

Pyros^® Kinetix^® Flex 및 Pyros^® eXpress 소프트웨어는 탁도 측정 동역학 분석을 수행하도록 검증되었습니다. 시료의 반응 시작 시간은 표준 곡선을 기준으로 하여 시료의 내독소 농도를 정량화합니다.

싸토리우스에서 수행된 동역학적 내독소 분석은 조화된 USP <85> 세균 내독소 및 EP 2.6.14 세균 내독소를 따릅니다.

규정에 따라 새로운 시료 매트릭스를 시험하기 전에 저해 및 증강 효과에 대한 시료 매트릭스 적격성 평가가 필요합니다.

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