혼합 림프구 반응 (MLR)

다중 면역표현형 분석 및 단일 웰에서 읽은 효과 사이토카인 농도

그림 2. 단일 웰에서 체크포인트 억제제 약물로 유도된 사이토카인 방출 및 마커 발현 측정

수지상세포(DCs)를 IL-4, 과립효소 B, LPS와 함께 밤새 해동 및 활성화한 후 96웰 플레이트에 40,000개/웰로 플레이팅했습니다. B/Green 인코딩 염료로 표지된 CD4+ T 세포를 3:1 T 세포-대-DC 비율로 추가했습니다. T 세포 활성화를 촉진하기 위해 체크포인트 억제제 약물 페므롤리주맙(항-PD-1 단클론 항체)의 다양한 농도를 추가했습니다. 사이토카인 샘플은 2일과 6일에 분석했습니다. 마커 발현은 분석 종료 시점(6일)에 분석했습니다. 샘플은 iQue^® 인간 T 세포 활성화 키트와 iQue^® 3 HTS 플랫폼을 사용하여 IFNγ 방출, TNFα 방출 및 CD25 발현에 대해 분석했습니다.

약리학적 분석에 적합한 T 세포 반응 측정 생성

그림 3. iQue Forecyt^®를 통한 자동 EC₅₀ 계산으로 약물 유도 T 세포 반응 정량화

수지상 세포(DC)를 (40K/well)에 인코딩된 CD4+ T 세포(T 세포-DC 비율 3:1)와 함께 파종하고 펨브롤리주맙으로 처리했습니다. 10 µL 샘플을 2일과 6일에 iQue Qbeads^® 인체 염증 패널 키트를 사용하여 분석했습니다. IL-2(pg/mL) 방출을 보여주는 히트맵. 대조군 웰에는 약물 없이 T 세포와 수지상 세포가 포함되었습니다. 곡선은 염증성 사이토카인의 시간적, 펨브롤리주맙 농도 의존적 방출을 강조합니다. 2일째, IL-2 방출에 대한 EC₅₀는 0.53 µg/mL였으며, 6일째에는 모든 IL-2 생성이 중단되었습니다. IL-6, CCL2, CCL3 수준은 2일에서 6일 사이에 모두 증가했으며, 6일째 CCL2와 CCL3 방출의 EC₅₀ 값은 각각 0.98과 1.0 µg/mL로 매우 유사했습니다.

96 또는 384웰 플레이트에서 마커 및 사이토카인의 신속한 정량을 통해 스크리닝 및 프로파일링 연구를 용이하게 합니다.

그림 4. 384웰 분석 형식을 사용하여 여러 PBMC 공여자 쌍에서 체크포인트 억제제로 유도된 사이토카인 방출 효과를 신속하게 프로파일링 

여러 공여자의 PBMCs(80K/well)를 단독(단일 공여자 대조군) 또는 조합(총 8개 공여자 쌍)으로 파종했습니다. 세포들은 여러 농도의 항-CTLA4 체크포인트 억제 항체로 처리되었습니다. PHA와 MMC가 포함된 혼합 PBMCs는 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용되었습니다. 3일 후, 샘플들은 IFNγ iQue Qbeads^®를 사용하여 사이토카인 농도를 분석하고 표준 곡선을 이용해 농도를 계산했습니다. 열 지도는 PBMC 공여자 쌍 간 항-CTLA4로 유도된 IFNγ 방출의 차이를 강조합니다. 막대 그래프는 혼합 PBMCs가 단일 공여자 대조군보다 일관되게 더 많은 IFNγ를 방출했음을 보여줍니다. 이는 17 ng/mL 항-CTLA4 추가로 더욱 증강되었습니다. 공여자 쌍 7의 항-CTLA4에 대한 대표적인 농도-반응 곡선(EC₅₀ = 6.5 ng/mL)입니다.

실시간 데이터 분석 및 혁신적인 시각화 도구로 응답 시간 단축

그림 5. iQue Forecyt^®의 사전 설정 게이팅 및 자동화된 데이터 분석은 T 세포 활성화에 대한 즉각적인 판독을 제공합니다. 

CD4+ T 세포를 두 명의 서로 다른 공여자로부터 단일 공여자의 수지상 세포(DC)와 다양한 T__PH_0__ 비율로 별도로 공동 배양했습니다. 각 T 세포 공여자는 DC 공여자의 HLA 대립유전자와 다른 정도의 불일치를 가졌습니다. 공여자 1 T 세포는 HLA 프로파일에서 DC 공여자와 더 유사하여 3/8 대립유전자만 불일치(HLA-A, -B, -C 및 -DR 대립유전자 2개)했지만, 공여자 2 T 세포는 7/8 대립유전자가 불일치했습니다. 대조군에는 단독 배양된 T 세포(음성) 또는 Dynabeads나 Immunocult(양성)와 함께 배양된 T 세포가 포함되었습니다. 분석은 iQue^® 인간 T 세포 활성화 키트를 사용하여 수행되었습니다. 플레이트 보기는 CD4+ 집단 내 CD25 발현의 웰별 차이를 보여줍니다. T 세포 활성화는 T__PH_1__ 비율이 감소함에 따라 증가하며, 공여자 2 T 세포에서 더 크게 나타납니다. 이는 HLA 대립유전자의 높은 불일치가 '비자기' 세포의 인식을 촉진하기 때문으로 예상됩니다. 등고선 그래프는 공여자 1과 공여자 2의 CD25 양성 T 세포 비율(3:1 T__PH_2__ 비율)을 보여줍니다. 막대 그래프는 CD4+ 집단의 CD25 세포 비율을 정량화합니다.