고처리량 스크리닝(HTS)의 기본: 유세포 분석법

유세포 분석법은 형광을 사용하여 세포의 물리적, 생화학적 특성을 측정하는 강력한 기술입니다. 다음과 같은 특징을 제공합니다:

• 초고속 처리: 초당 수만 개의 입자 분석 가능
• 단일 세포 또는 비드 분석: 개별 세포나 비드 측정
• 다중 매개변수 측정: 한 개의 세포에서 동시에 여러 매개변수 분석
• 풍부한 데이터: 수백만 개 세포에 대한 정보 수집

유세포 분석법은 형광을 사용하여 세포와 세포 유사 입자의 내재적, 외재적, 물리적, 생화학적 특성을 측정하는 잘 확립되고 널리 사용되는 강력한 기술입니다. 이 방법은 개별 세포의 분석물을 신속하게 계산하고 측정하여 다양한 생물학적 특성과 지표를 분석할 수 있습니다.

유세포 분석법 기초:

• 광산란 & 형광: 세포의 특성을 측정합니다.
• 장비: 세포가 액체 상태에서 단일 열로 이동하며, 레이저와 검출기에 의해 감지됩니다.
• 데이터 분석: 신호는 디지털 값으로 변환되어 컴퓨터에 표시됩니다.

생물학적 세포나 입자는 빛을 산란시키고 고유한 형광을 가질 수 있습니다. 유세포 분석법은 이러한 특성을 정성적, 정량적 측정에 활용합니다. 항체와 같은 형광 표지 마커를 사용하면 단일 세포의 다양한 특징을 식별할 수 있습니다. 형광은 특정 파장의 빛에 의해 흥분하고 더 높은 파장의 빛을 방출할 수 있는 능력입니다.

전방 산란, 측방 산란 또는 형광과 같은 검출기 측정은 "매개변수"이며, 해당 매개변수 값을 가진 각 검출 가능한 개체는 "이벤트"입니다. 형광 및 산란 신호는 전기 펄스를 생성하여 펄스 높이, 면적, 너비와 같은 특성을 캡처합니다. 원치 않는 부스러기를 제외하기 위해 실행 시작 시 트리거와 임계값이 설정됩니다. 노이즈로부터 개체를 구분하기 위해 이득(전압)이 적용되며, 신호 범위에 영향을 미칩니다. 초기 실행에서는 각 검출기의 이득을 조정합니다. 미표지 세포와 같은 음성 대조군은 항상 포함되어야 합니다. FCS 파일이라고 불리는 데이터 파일은 매개변수 강도와 장치 설정을 저장하며, 히스토그램 및 플롯과 같은 형식으로 시각화할 수 있습니다.

형광 연구에서 로그 증폭은 약한 신호를 확장하고 강한 신호를 압축하여 다양한 강도를 더 쉽게 표시할 수 있습니다. 선형 스케일링은 세포 주기 분석과 같은 낮은 동적 범위 신호에 더 적합합니다. 세포 분류 및 세포 자멸사를 포함한 다양한 분석을 위해 형광 염료, 항체 및 단백질로 분자를 표지할 수 있는 많은 도구가 있습니다. 일부 염료는 생존 세포에 들어가고, 다른 염료는 손상된 세포에만 들어가 생존 세포와 사멸 세포를 구분합니다.

탠덤 형광 색소는 결합된 형광 색소 사이의 에너지 전달을 통해 색상 분석을 증가시킵니다. 형광 단백질은 단백질 발현을 나타내고, 양자 점은 더 좁은 방출 피크를 제공합니다. 다색 형광은 복잡한 집단 분석을 가능하게 하며, 형광 색소의 수는 레이저와 검출기에 따라 달라집니다.

배경 검출 수준을 설정하여 표지된 개체의 형광에 초점을 맞춥니다. 중첩된 스펙트럼은 민감도를 감소시킬 수 있지만, 추가 레이저는 신호 정의를 향상시킵니다. 보상은 원치 않는 신호를 제거하기 위해 대조군을 사용하여 형광 누출을 보정합니다. 염료 염색 최적화는 중요하며, 배양 시간 및 염료-개체 비율과 같은 요인을 포함합니다. 적절한 해상도를 위해서는 충분한 염료가 필요하며, 신호 대 노이즈 비율을 최대화하기 위해 적정을 통해 달성할 수 있습니다.

단일 세포 현탁액으로 샘플을 제시하는 것이 중요합니다. 이는 기계적 분리 및 탈착, 효소 용액 또는 칼슘 킬레이션을 사용하여 달성할 수 있으며, 이는 단일 세포 현탁액에 일반적입니다. 항체 희석 및 버퍼 세척은 비특이적 결합을 방지합니다. 샘플 현탁액은 1차 및 2차 항체, 스트렙타비딘, 형광 색소와 같은 구성 요소와 함께 배양됩니다. 알려진 형광 색소 양을 가진 빈 및 대조군 샘플은 유량과 전압을 최적화하기 위해 테스트 샘플과 함께 사용됩니다.

유세포 분석 비즈는 품질 관리, 표준화 및 보상을 통해 프로세스를 향상시키는 비생물학적 미세구입니다. 이들은 장비 정렬의 변동을 줄여 데이터의 정확성, 신뢰성 및 재현성을 개선합니다.

• 품질 관리 비즈는 교정, 보상, 계수에 사용되며, 장비가 사양을 충족하도록 보장합니다.
• 보상 비즈는 다색 패널에서 형광 누출을 최소화하며, 특히 자동 보상을 사용할 수 없는 경우에 유용합니다.
• 계수 비즈는 비즈와 세포 수를 비교하여 입자 농도를 계산하는 데 도움을 주어 정확한 세포 수를 제공합니다. 이 비즈는 용해, 염색, 세척 후에 추가됩니다. 알려진 세포 샘플과 정확한 양의 비즈를 혼합하고, 이벤트 비율을 사용하여 세포 수를 결정합니다.

유세포 분석은 검출기 신호를 사용하여 SSC, 형광 또는 FSC의 펄스 피크를 생성하고, 이는 '도트 플롯'으로 시각화됩니다. 게이팅은 세포 하위 집단을 분리하고 죽은 세포 및 부스러기와 같은 원치 않는 이벤트를 제거하는 핵심 도구입니다. 적절한 게이팅은 데이터 정확성을 향상시킵니다.

• 도트 플롯, 히스토그램, 히트맵, 클러스터 다이어그램과 같은 시각화를 통해 전기 신호를 해석하는 데 핵심적입니다. '도트 플롯'은 흐름 경로를 지나는 생물학적 개체의 피크 영역 또는 피크 높이를 그래픽으로 시각화하는 방식입니다. 각 점은 흐름 세포의 한 이벤트를 나타내며, 하나의 그래프에서 수백만 개의 개체를 시각화할 수 있게 합니다.
• 유세포 분석의 전통적인 경로는 '게이팅'을 통해 이루어집니다. 게이트와 영역은 일반적으로 전방 산란, 측방 산란, 마커 발현을 기반으로 공통된 특성을 가진 세포 집단 주위에 배치되어 이러한 관심 집단을 조사하고 정량화합니다.
• 두 생물학적 개체가 서로 붙거나 흐름 셀을 너무 가깝게 통과하면, 단일 세포에 비해 피크 면적과 너비가 더 커집니다. 싱글렛 게이트를 사용하여 피크 높이의 증가 없이 피크 면적이 증가하는 생물학적 개체를 제거할 수 있습니다. 이중 이벤트를 게이트 밖으로 내보내는 것이 중요한데, 이는 특정 개체에 대해 인위적으로 높은 형광 결과를 초래할 수 있기 때문입니다.

고처리량 스크리닝(HTS)은 최소한의 분석 부피를 사용하여 비용을 낮추고, 일반적으로 96- 또는 384-웰 마이크로플레이트에서 대량의 샘플을 스크리닝하는 데 이상적입니다. HTS 스크리닝은 일반적으로 조사할 매개변수는 적지만 현저히 큰 샘플 크기를 가집니다.

자동화는 다음과 같은 범위에서 유용합니다:

• 샘플 및 시약 추가, 혼합, 배양, 검출을 위해 분석 마이크로플레이트를 운반하는 로봇 팔로 구성된 완전 통합 자동화 시스템.
• 비감독 분석을 지원하는 간단한 플레이트 로딩 장비.

iQue^® HTS 사이토메터는 강력한 통합 iQue Forecyt^® 소프트웨어가 지원하는 HTS에 적합한 속도와 사용성을 갖춘 다중 매개변수 세포 및 비드 분석의 완벽한 조합을 제공합니다. iQue^® 플랫폼의 핵심 차별점은 전체 96웰 플레이트를 최대 5분 만에 연속적으로 샘플을 수집하고 분석할 수 있는 에어갭 기술에 있습니다.