형질전환 시약 및 pDNA 제품에 대한 자주 묻는 질문

FectoVIR^®-AAV는 AAV 생산 공정의 원료로 사용되는 형질전환 시약입니다. FectoVIR^®-AAV는 시판되는 다른 형질전환 시약보다 생산성이 높고 전체 생산 비용을 절감합니다.

FectoVIR^®-AAV의 구조는 기밀이며, Polyplus에서 특허를 출원했습니다. PEIpro^®, FectoVIR^®-AAV 및 FectoVIR^®-LV는 분자 구조와 제형 모두에서 서로 다릅니다.

유통기한은 "My Sartorius"에서 확인할 수 있는 분석 증명서에 명시되어 있습니다.

저희는 FectoVIR^®-AAV를 HEK-293T, HEK-293F, Expi293, VPC, VPC2.0 등과 같은 부유형 HEK-293 파생 균주에 성공적으로 사용해 왔습니다. 고객들은 FectoVIR^®-AAV가 여러 상용 및 자체 개발 부유형 HEK-293 서브클론에서 잘 작동함을 확인했습니다.

당사는 자체적으로 AAV-2, AAV-5, AAV-8 및 AAV-9를 생산합니다. 고객사들은 더 많은 혈청형에 대해 테스트를 진행했으며, 유사한 수율 향상을 확인했습니다.

FectoVIR^®-AAV는 부유 및 부착 시스템 모두에서 바이러스 역가 측면에서 현저한 개선을 보여줍니다.

렌티바이러스 생산에는 FectoVIR^®-LV를 권장합니다. 이 제품은 부착성 및 부유성 세포 배양 시스템 모두에서 현재 이 용도에 가장 적합한 제품입니다.

FectoVIR^®-AAV GMP는 ICH Q7 GMP 파트 II 가이드라인을 준수하여 제조되며, 검증된 무균 제조 공정을 보장합니다. 또한, FectoVIR^®-AAV GMP는 IND(임상시험계획승인신청)를 지원하고 제품의 완벽한 추적성을 보장하는 모든 규제 관련 문서를 제공합니다. 제약 가이드라인을 준수하여 트랜스펙션 시약을 제조하면 위험을 줄이고 환자의 안전을 확보할 수 있습니다.

FectoVIR^®-LV는 유전자 변형 세포 치료(CAR-T, CAR-NK, 유전자 변형 줄기세포 치료 등)에 사용되는 렌티바이러스 벡터를 생산하는 차세대 형질전환 시약입니다. 이 새로운 분자를 개발하는 데 3년이 걸렸으며, 마침내 LVV 역가를 높일 수 있는 형질전환 솔루션을 찾아냈습니다.

유통기한은 "My Sartorius"에서 확인할 수 있는 분석 증명서에 명시되어 있습니다.

FectoVIR^®-LV GMP는 현재 개발 중입니다.

PEIpro^®는 혈청 함유 또는 무혈청 배지에서 배양된 부착 세포 및 부유 세포 모두에서 대규모 바이러스 생산(주로 AAV 및 LV이지만 다른 바이러스도 포함)을 위해 특별히 개발되었습니다. PEIpro^®는 광범위한 품질 관리(QC)를 거쳐 치료용 바이러스 생산에 적합합니다.

PEIpro^®, PEIpro^®-HQ 및 PEIpro^®-GMP는 분자량이 기밀 정보인 선형 폴리에틸렌이민(PEI)으로 구성됩니다. 시험관 내에서 가장 낮은 세포 독성을 나타내면서 최적의 DNA 전달을 위한 선형 PEI를 선택하기 위해 광범위한 최적화 실험이 수행되었습니다.

PEIpro^®는 선형 PEI의 수용액 형태로 제공됩니다.

PEIpro^®는 우발적인 동결/해동 과정을 거쳐도 형질전환 효율에 영향을 미치지 않습니다. 그러나 장기간 보관 시에는 안정성을 확보하기 위해 5°C ± 3°C에서 보관하는 것을 권장합니다.

유통기한은 "My Sartorius"에서 확인할 수 있는 분석 증명서에 명시되어 있습니다.

바이러스 벡터의 종류에 따라 HEK-293 세포의 아형이 다르게 사용됩니다. 예를 들어 아데노바이러스 및 AAV 바이러스 생산에는 HEK-293 세포가, AAV 및 렌티바이러스 생산에는 HEK-293T 및 HEK-293FT 세포가 적합합니다. PEIpro는 부착성 및 부유성 HEK-293 세포 모두에서 바이러스 생산에 적합합니다.

HYPERFlasks™ 및 HYPERstacks™(Corning)와 같은 다층 플라스크 또는 iCELLis^® 바이오리액터(Pall)와 같은 고정층 배양 시스템을 포함한 다양한 배양 용기는 부착성 HEK-293 세포에서 PEIpro^®를 사용하는 데 적합합니다. 부유성 HEK-293 세포에서 바이러스를 생산하려면 대형 셰이커 플라스크 또는 바이오리액터를 사용할 수 있습니다.

다른 많은 형질전환 시약과는 달리, 당사의 모든 제품은 혈청과 호환되므로 혈청이 함유된 배지에서 세포에 직접 첨가할 수 있습니다.

당사 제품의 형질전환 효율은 항생제 존재 여부에 영향을 받지 않습니다. 예를 들어, ^®의 각 신규 배치에 대한 일상적인 검증 프로토콜은 항상 혈청 및 항생제가 포함된 배지에서 수행됩니다.

포유류 세포를 배양하고 유지하는 데 사용되는 다양한 세포 배양 배지 중 일부는 양이온성 고분자/지질 매개 형질전환을 저해할 수 있습니다. 세포 배지와 형질전환의 호환성에 대한 자세한 내용은 당사 전문가에게 문의하십시오.

계대 배양 횟수는 형질전환 효율에 영향을 미칩니다. 세포를 장기간 배양했을 경우(20회 이상 계대 배양), 형질전환 효율이 감소하므로 액체 질소에서 해동한 새 세포를 사용하여 배양을 시작하는 것이 좋습니다. 반대로, 해동 후 형질전환 실험을 시작하기 전에 세포를 최소 두 번 이상 계대 배양해야 합니다.

세포 밀도는 형질전환 성능에 영향을 미칩니다. 형질전환 시 권장되는 세포 밀도는 사용하는 형질전환 시약에 따라 다를 수 있습니다. 형질전환 당일에 원하는 세포 밀도를 얻기 위한 권장 세포 수는 해당 시약의 프로토콜을 참조하십시오.

이 비율은 사용할 트랜스펙션 시약 1마이크로리터당 핵산의 양(마이크로그램)에 해당합니다. 예를 들어, 1:2 비율은 트랜스펙션 시약 2마이크로리터당 핵산 1마이크로그램을 의미합니다.

There are several parameters that can be changed to improve the transfection efficiency. If you are looking for some optimization, contact our Scientific Support team at support@polyplus-transfection.com. 

jetOPTIMUS^®는 부착성 세포, 특히 형질전환이 어려운 세포의 일상적인 형질전환에 권장되는 시약입니다. 여러 플라스미드를 동시에 전달하거나 소규모 바이러스 생산에 적합합니다. jetOPTIMUS^®를 이용한 형질전환은 세포 생존력 및 형태에 미치는 영향을 최소화하면서 형질전환 효율과 유전자 발현을 향상시킵니다.

jetPRIME^®는 다양한 부착성 세포주에서 효과적이고 재현성 있는 DNA 및 siRNA 형질전환을 보장하는 다가성 형질전환 시약입니다. 이 다재다능한 시약은 DNA와 siRNA의 동시 형질전환에도 적합합니다. jetPRIME^®를 이용한 형질전환에는 소량의 핵산만 필요하므로 세포 독성이 매우 낮습니다.

jetPEI^® 트랜스펙션 시약은 역방향, 배치 및 순방향의 세 가지 프로토콜을 제공하여 자동 또는 수동 HTS(고처리량 스크리닝)에 특히 적합합니다. jetPEI^®는 재현성이 매우 높은 결과를 제공하며, DNA/jetPEI^® 복합체는 최대 4시간 동안 안정적입니다.

여러 플라스미드를 동시 형질전환할 경우, 각 웰당 총 DNA 양이 jetOPTIMUS^® 프로토콜에 명시된 최대 DNA 양을 초과하지 않도록 하는 것이 좋습니다. 각 플라스미드에 사용할 비율은 플라스미드의 크기, 구조 및 각 플라스미드의 예상 발현 수준에 따라 달라집니다. 각 플라스미드는 웰당 총 DNA 양의 최소 10%를 차지해야 합니다.

플라스미드 DNA/siRNA 동시 형질전환에는 jetPRIME^® 시약을 권장합니다. DNA 및 siRNA 동시 형질전환에 대한 표준 프로토콜은 다음 웹사이트를 참조하십시오.

DNA/ssODN 동시 형질전환(단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드)의 경우에도 동일한 프로토콜을 적용할 수 있습니다.

jetOPTIMUS^®는 상피세포, 간세포, 내피세포, 섬유아세포 등과 같은 일차 세포, 배아줄기세포, 중간엽줄기세포, 유도만능줄기세포 및 암세포주와 같이 유전자 도입이 어려운 세포의 DNA 도입에 매우 적합합니다.

However, some suspension and primary cells, such as lymphocyte cell lines, fibroblasts or neurons, are very difficult to transfect with DNA Polyplus^® developed a lipid-based transfection reagent jetMESSENGER^®. It was designed for mRNA delivery and showed high efficiency on a wide variety of difficult to transfect cells including lymphoma and blood cell lines, neurons and various primary cells. Compared to DNA, mRNA transfection leads to a high percentage of transfected cells, faster protein expression following transfection, and no risk of genomic insertion in contrast to plasmid or viral vectors

jetOPTIMUS^® 또는 jetPRIME^®를 사용하여 최적의 형질전환 효율을 얻으려면 복합체 형성 시간을 10분 이내로 유지하는 것이 좋습니다. 따라서 고처리량 스크리닝과 같이 더 긴 배양 시간이 필요한 응용 분야에는 jetPEI^®를 사용하는 것이 좋습니다. jetPEI^®/DNA 및 DNA/jetOPTIMUS^® 복합체는 최대 4시간 동안 안정적이기 때문입니다.

해당 시약을 이용한 DNA 형질전환에는 크기 제한이 없습니다. 그러나 동일한 양의 DNA를 사용할 경우, 큰 DNA 구조물일수록 작은 플라스미드보다 유전자 복제 수가 적다는 점에 유의해야 합니다.

jetOPTIMUS^®는 DNA와 상호작용하여 양전하를 띤 복합체를 형성하고, 이 복합체는 세포내이입을 통해 세포 안으로 침투합니다. 세포내이입체는 양성자 스펀지 메커니즘(Behr, Chimia 1997)을 통해 DNA를 세포질로 방출합니다. 플라스미드는 주로 핵막이 사라지는 세포 분열기 동안 핵에 도달합니다. 이러한 이유로, 일차 세포나 세포 분열 속도가 느린 세포주는 일반적으로 형질전환이 어렵습니다.

INTERFERin^®는 siRNA 트랜스펙션에 가장 적합한 시약이며, 1 nM의 낮은 농도의 siRNA로도 효과를 발휘합니다.

jetPRIME^®는 고농도(10~50nM 사용)의 siRNA 전달에 적합하며 DNA/siRNA 동시 전달 시에 권장됩니다.

또한, siRNA 또는 miRNA를 생체 내에 전달하고자 하는 경우, 이 용도에 가장 적합한 시약은 in vivo-jetPEI^®입니다.

shRNA는 플라스미드 벡터 또는 올리고뉴클레오티드 형태로 형질전환될 수 있습니다. shRNA를 올리고뉴클레오티드 형태로 형질전환하는 경우에는 INTERFERin^®를 권장합니다. 그러나 shRNA를 발현하는 벡터를 사용하는 경우에는 jetOPTIMUS^® jetPRIME이 더 적합한 시약입니다. shRNA의 생체 내 전달에는 in vivo-jetPEI^® 사용을 권장합니다.

저희의 jetPEI^®는 모든 동물 모델에 올리고뉴클레오티드를 전달하는 데 적합한 강력한 고분자 기반 시약입니다. 사용 방법은 기존의 유전자 도입법과 유사합니다. 핵산과 시약을 혼합하여 동물에게 투여하기만 하면 됩니다.

단일 가닥 올리고뉴클레오티드 전달에는 jetPRIME^® 시약을 사용하는 것을 권장합니다.

플라스미드 DNA와 ssODN 동시 형질전환(예: CRISPR/Cas9 응용)의 경우, 당사에서 제공하는 DNA 및 siRNA 동시 형질전환 표준 프로토콜을 참조하십시오.

여러 종류의 분자들이 miRNA라는 용어로 잘못 불리는 경우가 있습니다. miRNA라는 용어는 다음과 같은 것들을 지칭할 수 있습니다.

miRNA 모방체: 이들은 siRNA와 구조적으로 유사하지만 동일하지는 않으며, INTERFERin^®를 사용하여 형질전환할 수 있습니다. miRNA를 코딩하는 플라스미드: 이 분자는 jetOPTIMUS^®를 사용하여 형질전환할 수 있습니다. antimiR: 이는 내인성 마이크로RNA에 특이적으로 결합하여 억제하도록 설계된 단일 가닥 핵산이며, INTERFERin^®를 사용하여 형질전환할 수 있습니다.

동일한 양의 올리고뉴클레오티드를 형질전환하더라도, 올리고뉴클레오티드의 크기에 따라 전달되는 유전자 복제본의 수가 달라집니다 (긴 올리고뉴클레오티드일수록 복제본 수가 적고, 짧은 올리고뉴클레오티드일수록 복제본 수가 많습니다). 따라서 올리고뉴클레오티드의 양은 이에 맞춰 조정해야 합니다.

시험관 내 mRNA 형질전환에는 jetMESSENGER^®가 저희가 선호하는 시약입니다. jetMESSENGER^® 프로토콜은 매우 간단합니다. 이 시약은 바로 사용할 수 있으며, 다양한 부착성 및 부유성 세포의 표준 배양 배지(혈청 및 항생제 첨가 여부와 관계없이)와 호환됩니다. jetMESSENGER^®는 매우 부드러운 방식으로 작용하며, 쥐 대뇌 피질 신경 세포, 인간 간암 세포, 마우스 배아 줄기 세포와 같이 형질전환이 어려운 다양한 세포에서 세포 생존력과 전반적인 세포 형태를 유지합니다.

생체 내 mRNA 전달에 있어, in vivo-jetRNA^®+는 동급 최고의 시약입니다. in vivo-jetRNA^®+는 생체 내 mRNA 전달을 위해 특별히 개발된, 미리 형성된 리포솜으로 구성된 즉시 사용 가능한 트랜스펙션 시약입니다. 이 시약은 다양한 동물 모델(마우스, 랫트 등)에서 전신 주사 경로를 이용하여 특정 장기 또는 여러 장기를 표적화하는 데 사용할 수 있습니다. in vivo-jetRNA^®+를 이용한 mRNA 전달은 간단한 2단계 프로토콜로 사용이 간편하며, 지질 나노입자(LNP)와 유사한 전달 효율을 제공합니다. in vivo-jetRNA®+는 백신 접종/면역화, 항암 연구, CRISPR/Cas9 방법을 이용한 유전자 편집 또는 단백질 대체 등에 활용될 수 있습니다.

LipidBrick^® 제품군은 지질 나노입자(LNP) 제형에 특화된 다양한 양이온성 지질을 제공합니다. 이러한 활성 지질은 mRNA 분자를 보호하고 LNP의 형질전환 능력에 중요한 역할을 합니다. 특히, 이미다졸륨 극성 헤드를 기반으로 하는 LipidBrick^®는 LNP에 전체적인 양전하를 부여하여 효능 및 생체 분포 측면에서 기존 LNP의 적용 범위를 넓힙니다. 이는 이온화 가능한 지질을 기반으로 하는 LNP에 비해 mRNA를 폐와 비장으로 더 많이 전달하고 간에 축적되는 것을 줄이는 효과를 가져옵니다. 또한, LipidBrick® 제품군 내에서 LipidBrick^® IM21.7c는 jetMESSENGER^® 및 in vivo-jetRNA®+ 제형에 사용되는 양이온성 지질(활성 지질)로서, 당사의 기성 시약과 고객의 요구 및 응용 분야에 맞춘 LNP 제형 간의 원활한 전환을 가능하게 합니다.

mRNA는 시판되는 솔루션(예: New England Biolabs에서 제공하는 HiScribe™ 키트)을 사용하여 DNA 템플릿으로부터 시험관 내 전사(IVT)하거나 Trilink, Eurofins, Aldevron 등과 같은 다양한 올리고뉴클레오티드 공급업체를 통해 "맞춤 제작"하여 구매할 수 있습니다.

당사의 D-zyvec 플랫폼을 이용하면 고객의 mRNA 요구사항에 맞춰 특별히 설계된 선형 DNA 템플릿을 제작할 수 있습니다. 더 자세한 정보는 당사 과학 지원팀(문의하기)으로 문의해 주십시오.

참고로, DNA 주형은 선형화되어야 하며, 전사될 서열의 상류(센스 RNA의 경우 5' 말단, 안티센스 RNA의 경우 3' 말단)에 T7 또는 SP6과 같은 RNA 중합효소 프로모터 영역을 포함해야 합니다. 필요한 경우, 최소 프로모터 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 전사될 서열 상류에 RNA 중합효소 프로모터 영역을 추가할 수 있습니다.

일반적으로 시험관 내 전사 후 mRNA 정제는 RNA 오염이 최소화되므로 필요하지 않습니다. 필요한 경우 페놀-클로로포름 추출/에탄올 침전, 염화리튬 침전, 겔 정제법, 그리고 시판되는 여러 mRNA 분리 키트를 포함한 다양한 방법을 사용할 수 있습니다.

mRNA 크기 자체에는 제한이 없습니다. 다만, mRNA 합성 키트는 일반적으로 0.3~5kb 크기의 mRNA 전사체(단백질 분자량 10~150kDa에 해당)에 최적화되어 있다는 점을 유념해야 합니다. 따라서 이보다 짧거나 긴 mRNA 전사체의 경우, 비슷한 수준의 높은 수율을 얻기 위해서는 추가적인 최적화 과정이 필요할 수 있습니다.

DNA 트랜스펙션과 비교했을 때, jetMESSENGER^® 및 in vivo–jetRNA^®+를 이용한 mRNA 매개 트랜스펙션은 유사한 기간 동안 프로모터에 의존하지 않는 보다 제어된 유전자 발현을 가능하게 합니다. 활발하게 분열하는 세포에서는 트랜스펙션 후 1~4일 사이에 mRNA 발현이 더욱 뚜렷하고 안정적으로 관찰됩니다. 분열 속도가 느리거나 분열하지 않는 세포에서는 mRNA 발현이 더 오랜 기간 동안 안정적으로 유지될 수 있으며, 예를 들어 일차 신경 세포에서는 최대 7일까지 관찰됩니다.

진핵세포의 내인성 mRNA 합성 과정에서, 새로 생성된 전사체의 5' 말단에 7-메틸구아노신 CAP가 첨가되어 분해를 방지하고 번역 속도를 증가시킵니다. 새로 생성된 mRNA의 3' 말단에 존재하는 폴리A 꼬리는 분해를 더욱 억제하고 성숙 mRNA의 핵외 이동에 관여합니다. 따라서 기존의 mRNA 합성 키트는 일반적으로 5' 캡 유사체와 3' 폴리A 꼬리를 도입하여 mRNA의 안정성을 향상시키는 솔루션을 제공합니다. 또한, 5-메틸시토신 및/또는 N6-메틸아데닌과 같은 특정 염기 변형을 mRNA 서열 내에 도입하여 안정성을 높이고 면역원성을 낮출 수 있습니다. 올리고뉴클레오티드 공급업체에 맞춤형 mRNA를 주문할 경우, 안정성 향상을 위해 유사유리딘과 같은 특정 변형을 추가할 수 있습니다.

RNA 전사체의 안정성을 높이는 것이 항상 필요한 것은 아닙니다. 예를 들어, 일부 바이러스 RNA 전사체는 형질전환 후 복제를 시작하거나 감염성 바이러스를 생성하기 위해 캡핑 및 폴리아데닐화될 필요가 없습니다.

mRNA 전달 방식은 일시적인 발현에는 적합하지만 안정적인 클론 생성에는 적합하지 않습니다. mRNA는 세포 게놈에 통합될 수 없으므로 안정적인 클론 생성이 불가능하지만, 숙주 세포의 게놈을 변형시키지 않는다는 장점이 있습니다.

CRISPR 매개 유전자 편집은 형질전환을 통해 가이드 RNA와 Cas9 단백질을 표적 세포에 전달해야 합니다. 검증된 방법은 플라스미드 DNA 형태로 가이드 RNA와 Cas9 단백질을 전달하는 것을 기반으로 하며, 이를 위해 당사의 최신 기술인 jetOPTIMUS^®를 추천합니다. jetOPTIMUS^®는 가장 광범위한 종류의 일차 세포 및 세포주에서 최고의 유전자 편집 효율을 보장합니다.

기존의 플라스미드 기반 방법에서 발생하는 비표적 효과가 우려될 경우, DNA를 사용하지 않는 유전자 편집 방법이 고려됩니다. gRNA와 Cas9 단백질을 mRNA 형태로 전달하는 것은 부착 세포와 부유 세포 모두에서 높은 유전자 편집 효율을 달성하기 위해 가장 빈번하게 사용되는 DNA를 사용하지 않는 대안입니다.

Cas9 및 가이드 RNA를 인코딩하는 mRNA를 사용하는 완전한 RNA 접근법에는 당사의 jetMESSENGER® 트랜스펙션 시약을 권장합니다.

마지막으로, Cas9를 인코딩하는 플라스미드 DNA와 RNA 형태의 gRNA를 혼합하는 접근 방식의 경우, 가장 적합한 시약은 jetPRIME^®입니다.

생체 내 CRISPR 매개 유전자 편집에 있어 저희가 선택한 시약은 in vivo-jetPEI^®입니다. 여러 연구 그룹에서 in vivo-jetPEI^®를 이용한 마우스 유전자 편집 결과를 발표했습니다.

주커만, M. 외 (2015). .

He, S.& al. (2016)

타카오 T. 미국국립과학원회보(Proc Natl Acad Sci U S A) 28579-28581

Pallarès-Masmitjà M.  Nat Commun7071 

McFadden T.Nutr 신경과학1-13

in vivo-jetPEI^®는 DNA, siRNA, mimic miRNA 및 기타 올리고뉴클레오티드와 같은 모든 유형의 핵산을 생체 내에서 전달하는 데 적합한 즉시 사용 가능한 고분자 기반 트랜스펙션 시약입니다.

in vivo-jetRNA^®+는 생체 내 mRNA 전달을 위해 특별히 개발된, 바로 사용할 수 있는 지질 기반 트랜스펙션 시약입니다.

LipidBrick^®는 지질 나노입자(LNP) 제형에 특화된 양이온성 지질 제품군입니다. 이 활성 지질은 mRNA 분자를 보호하며 LNP의 유전자 전달 능력에 중요한 역할을 합니다.

in vivo-jetPEI^®는 생쥐에서 핵산 전달에 이상적입니다. 하지만 이 프로토콜은 매우 간단하고 활용도가 높아 쥐, 모기, 새우, 기니피그, 마카크 원숭이 등 다른 여러 종에도 적용 가능합니다.

in vivo-jetRNA^®+는 매우 간단한 2단계 프로토콜로 바로 사용할 수 있는 시약입니다. 비교적 최근에 출시된 시약(2022년 말)으로, 현재까지 쥐와 생쥐를 대상으로 사용되었습니다.

귀하의 동물 모델에 맞게 프로토콜을 조정하려면 언제든지 저희 과학 지원팀에 문의하십시오. 연락처는 다음과 같습니다.

in vivo–jetRNA^®+와 in vivo–jetPEI^®는 전신 및 국소 핵산 전달에 적합합니다. 정맥 주사(꼬리 정맥 및 안와 후방 정맥), 복강 주사, 종양 내 주사, 뇌내 주사, 비강 내 투여 등 여러 투여 방법이 성공적으로 시험되었습니다.

전달 절차는 표적 장기에 따라 크게 달라집니다. 투여 경로에 따라 in vivo-jetRNA^®+ 또는 in vivo-jetPEI^® 매개 유전자 발현은 뇌, 간, 췌장, 비장, 신장, 심장, 방광, 피부, 망막 등에서 관찰됩니다.

중요한 점은 LipidBrick^®가 이미다졸륨 극성 헤드를 기반으로 함으로써 LNP에 전체적인 양전하를 부여하여 효능 및 생체 분포 측면에서 기존 LNP 응용 분야의 범위를 넓힌다는 것입니다. 이는 이온화 가능한 지질을 기반으로 하는 LNP에 비해 mRNA를 폐와 비장으로 더 많이 전달하고 간에 축적되는 것을 줄이는 효과를 가져옵니다.

더 자세한 조언이 필요하시면 저희 과학 지원팀에 문의해 주십시오.

핵산과 생체 내 제트 PEI^® 사이에 형성된 복합체는 시간이 지나도 응집체를 형성하지 않으며 실온(37°C)에서 최소 4시간, 4°C에서 최대 7일 동안 안정적입니다.

반면, mRNA/in vivo-jetRNA^®+ 복합체는 실온에서 최대 72시간, 4°C에서 최대 1개월 동안 안정적입니다.

따라서, 복합체를 미리 제조할 수 있으므로, 삼투압 펌프를 이용한 연속 투여에 적합합니다.

당사는 미국 및 유럽 연합의 현행 의약품 제조 및 품질관리 기준(cGMP)을 준수하여 제조된 GMP 등급의 생체 내 제트(in vivo-jet-PEI^®)를 제공하며, 이는 1상부터 3상까지의 인체 임상 시험에 사용하기에 적합합니다. 이 시약은 전 세계적으로 점점 더 많은 치료법에 사용되고 있습니다.

in vivo-jetRNA^®+는 아직 GMP 등급으로 출시되지 않았지만, 고객 요청 시 GMP 등급으로 개발할 가능성이 있습니다(개발 기간은 12~18개월이며 최소 주문 수량이 필요합니다).

FectoPRO^®는 포유류 일시적 유전자 발현 시스템에서 최상의 결과를 얻고자 하는 과학자들을 위해 개발된, 부유 상태 단백질 생물 생산에 가장 적합한 시약입니다. FectoPRO^®는 다양한 배지에서 배양된 CHO 및 HEK-293 세포주에서 최고의 형질전환 효율과 단백질 수율을 보장합니다. 또한, FectoPRO^®는 우수한 세포 생존율, 재현성 및 결과의 일관성을 보여줍니다. FectoPRO^®는 시판되는 다른 어떤 시약보다 뛰어난 성능을 제공하며, 필요한 DNA 및 시약의 양을 동일하게 줄여주기 때문에 (어떤 규모의 생산 공정이든) 포유류 생물 생산 공정을 최적화할 수 있도록 해줍니다.

대규모 또는 초대규모 실험의 경우, PEIpro^®를 고려해 볼 만합니다. 이 제품은 HEK-293 세포에서 매우 효율적이며 비용 효율적이기 때문입니다.

부착 시스템에서 단백질을 생산하는 경우 PEIpro^® 또는 jetOPTIMUS^®를 고려할 수 있습니다.

FectoPRO^®는 FectoPRO^® 부스터 없이도 사용할 수 있지만, 적은 양의 DNA로 높은 단백질 수율을 얻으려면 부스터 사용을 권장합니다.

FectoPRO^®는 일반 및 고밀도 세포 배양 시스템 모두에서 탁월한 효과를 발휘합니다. FectoPRO^®를 사용하면 더 짧은 시간 내에 더 높은 수율을 얻을 수 있습니다. 재조합 단백질 생산을 위해 7일 또는 12일 동안 세포를 배양할 필요가 없습니다.

The optimal DNA amount, when used with the medium is 0.8 µg DNA per mL of cell culture as stated in the FectoCHO^® Expression system protocol. If you use FectoPRO^® with any other media refer to the FectoPRO^® protocol for guidance. However, it should be noted that with the synergistic association of the FectoCHO™ CD Expression medium and the FectoPRO^® powerful transfection reagent you will obtain better protein production yields.

FectoPRO^®와 PEIpro^®는 모두 부유 배양 및 무혈청 배지에서 HEK293 세포에 매우 효과적으로 작용하는 것으로 나타났습니다. 하지만 어떤 용도로 사용할지는 용도에 따라 다릅니다. FectoPRO^®는 단백질 생산에, PEIpro^®는 바이러스 생산에 사용됩니다.

아니요, FectoCHO™ 발현 시스템 키트는 세포를 FectoCHO™ CD 발현 배지에 적응시키고 FectoPRO^® 형질전환 시약을 사용하여 형질전환을 수행하는 데 완벽하게 적합하므로, 배지를 먼저 구매하고 형질전환 시약을 따로 구매할 필요가 없습니다. FectoCHO™ 발현 시스템 키트(제품 번호: 101000011)에는 1L의 배지와 1mL의 형질전환 시약이 포함되어 있어 세포 적응부터 단백질 생산까지 모든 실험을 진행할 수 있도록 최적의 비율로 구성되어 있습니다. 가격 관련 문의는 언제든지 연락 주시기 바랍니다.

사용하는 배지에 따라 1mL의 FectoPRO^®는 500mL에서 1L 사이의 배양액을 형질전환하는 데 충분합니다.

FectoCHO^® 발현 시스템을 사용하든 ExpiCHO™ 세포에서 ExpiCHO™ 발현 시스템을 사용하든 mL당 DNA 양은 동일합니다. 하지만 FectoCHO^®를 사용하면 더 낮은 비용으로 최대 두 배의 단백질 생산 수율을 얻을 수 있다는 점을 유념하십시오.

FectoCHO^® CD 배지는 ExpiCHO^® 세포의 배양 및 일시적 단백질 발현에 사용할 수 있습니다. 그러나 이 시스템은 바로 사용할 수 있는 플러그 앤 플레이 방식이 아니므로, 사전 적응 및 최적화 단계가 필요하다는 점에 유의해야 합니다.

지질 나노입자(LNP)는 임상적으로 승인된 유일한 비바이러스성 RNA 전달체입니다. 최근 코로나바이러스 발생 이후 mRNA 백신의 성공을 통해 LNP의 안전성이 입증되었습니다. COVID-19 백신은 LNP의 용이한 제형, 보호 특성 및 대용량 탑재 능력 덕분에 신속하게 LNP를 채택했습니다. 이제 LNP는 백신 접종을 넘어 인간 대상 mRNA 치료제 개발을 가속화하고 있습니다.

mRNA-LNP의 생체 분포 및 안정성을 개선하고 독성을 줄이기 위해서는 추가적인 연구 개발이 필요합니다. LNP 제형 내의 이온화 가능한 양이온성 지질은 형질전환되는 장기뿐만 아니라 mRNA 전달 효율 및 분해성에 영향을 미칩니다. 본 연구에서는 LipidBrick^®라는 이름의 LNP 제형에 사용되는 양이온성 지질을 개발했습니다. 이 지질들은 물리화학적 특성을 조절하여 제형화된 LNP의 효능 및 생체 분포에 영향을 미치는 동시에 mRNA 안정성을 향상시킬 수 있습니다.

저희는 "발견 등급*" 플라스미드를 원형 이중 가닥 DNA 분자 형태로, 나사 뚜껑이 있는 플라스틱 튜브에 담아 실온에서 1X AE 버퍼(미니프렙) 또는 1X TE 버퍼(미디, 맥시, 기가프렙)에 재현탁하여 제공합니다. 박테리아 스톡은 제공하지 않으니 유의하시기 바랍니다.

연구용 플라스미드는 다양한 형태로 주문 가능하며, 자세한 내용은 문의해 주십시오.

대규모 또는 고품질 플라스미드 생산을 원하시면 플라스미드 제조 서비스에 문의하십시오.

*디스커버리 등급이란 플라스미드가 우수 실험실 관리 기준에 따라 무균 환경에서 생산되지만, 품질 관리는 기본적인 품질 및 신원 확인 검사로 제한됨을 의미합니다. 디스커버리 등급 플라스미드는 연구 용도로만 사용해야 합니다.

품질 관리는 기본적인 품질 및 신원 확인 테스트로 제한됩니다.

• DNA 정량
• A260/280 및 A260/230 측정
• 제한 효소 소화 분석 결과 (겔 전기영동 또는 모세관 전기영동)
• 마이코플라스마 및 gDNA 검출을 포함한 전체 플라스미드 시퀀싱(NGS)
• (필요한 경우) 생거 시퀀싱

품질 관리 결과는 제품 납품서에 기록됩니다.

참고로, 신약 개발용 플라스미드의 경우 내독소 수치는 측정되지 않습니다.

대부분의 프로젝트에서는 기존 플라스미드나 기타 DNA 물질을 보내주실 필요가 없습니다. 원하는 서열은 DNA 합성(외부 위탁)을 통해 생성할 수 있습니다.

하지만 일부 프로젝트에서는 기술적 복잡성을 해결하거나, 기술적 연속성을 보장하거나, 단순히 비용을 절감하기 위해 저희가 사용할 수 있는 DNA 물질(플라스미드 템플릿 또는 정제된 gDNA만 해당)을 보내주셔야 할 수도 있습니다.

이 경우에는 다음 지침을 따르십시오.

• 1.5ml 플라스틱 튜브를 사용하고, 뚜껑을 돌려서 닫거나 파라필름으로 밀봉하십시오.
• 튜브에 라벨을 명확하게 붙여주세요.
• 최소 용량: 15µL
• 최소 농도: 100ng/µL
• 실온에서 보관하시고, 드라이아이스 사용은 피해주세요.

튜브는 다음 주소로 보내주십시오:

Sartorius Polyplus
Production Team
80 rue du Dr Yersin
59120 Loos
FRANCE

모든 프로젝트를 시작하기 전에 모든 플라스미드 템플릿은 NGS를 통해 전체 염기서열 분석을 거치게 된다는 점을 유의해 주십시오.

gDNA 샘플의 경우, 샘플의 무결성을 평가하기 위해 아가로스 겔 사진을 보내주시기 바랍니다.

저희는 DNA 합성을 자체적으로 수행하지 않고 외부 업체에 위탁합니다.

저희는 최대 30KB 크기의 플라스미드 조립에 성공했습니다. 더 큰 크기의 플라스미드는 일반적인 형질전환 균주에서 증폭하기 어려울 수 있습니다. 하지만 프로젝트에 이러한 대형 플라스미드가 필요한 경우, 특별한 해결책을 제시해 드릴 수 있으니 언제든지 문의해 주십시오.

저희는 스탠다드와 프리미엄, 두 가지 등급의 서비스를 제공합니다.

• 표준 서비스는 고객 제공 자료를 활용하여 제작하며, 납품까지 최소 5주*가 소요됩니다.
• 프리미엄 서비스는 전적으로 DNA 합성에 기반하며 3주*부터 제공될 수 있습니다.

* 구매 주문 확인서를 수령하는 즉시

수령 즉시, 조작된 플라스미드가 들어 있는 튜브를 원심분리기(벤치 원심분리)를 사용하여 짧게 원심분리한 후 다음 장소에 보관하십시오:

• 단기 보관(1개월 미만) 시 4°C에서 보관하십시오.
• 장기간 보관 시 -20°C

장기간 보관하고 동결-해동 과정을 피하려면 Polyplus 디스커버리 등급 플라스미드를 소분하여 보관하는 것을 강력히 권장합니다.

여기에 제시된 보관 기간은 참고용입니다. 장기간 보관된 플라스미드의 무결성은 겔 전기영동(변성) 또는 시퀀싱(서열 무결성)을 통해 항상 확인해야 합니다.

연구 목적에 맞게 설계된 발견 등급 플라스미드는 모든 연구 응용 분야에 맞게 직접 증폭할 수 있습니다.

저희가 제공하는 세균 복제 기점은 기존의 pBR322/pUc 플라스미드와 동일한 방식으로 작동합니다. 따라서 공급업체 지침에 따라 어떤 균주든 사용하실 수 있습니다. 제품 배송 명세서에는 플라스미드 증폭에 사용된 배양 온도와 항생제 선택 정보도 명시되어 있습니다. 참고로, 저희가 일반적으로 사용하는 항생제 농도는 암피실린 100µg/mL, 카나마이신 30µg/mL입니다.

저희는 저희가 제작한 유전자 조작 플라스미드 또는 고객님께서 보내주시는 플라스미드에 대한 pDNA 증폭 서비스를 제공합니다.

플라스미드 제조 서비스를 이용하면 소규모(수 mg까지) 및 탐색 단계 등급 또는 대규모(수 그램까지) R&D, 고품질 또는 GMP 등급으로 증폭을 수행할 수 있습니다.

프로젝트 사양에 달리 명시되지 않는 한, 연구 목적으로 서비스 계약에 따라 제공되는 모든 유전자 조작 플라스미드는 당사의 약관에 명시된 바와 같이 Polyplus의 지적 재산권으로부터 자유롭습니다. 다른 응용 분야의 경우 Polyplus 또는 관련 업체와의 라이선스 계약이 필요할 수 있습니다.

폴리플러스의 플라스미드 시퀀싱 서비스는 전체 플라스미드 시퀀싱에 특화되어 있습니다. 따라서 시작 물질은 정제된 이중 가닥 DNA 플라스미드여야 합니다.

저희는 어떠한 생물체의 전체 게놈 시퀀싱도 수행하지 않음을 알려드립니다.

아래 지침에 따라 샘플을 보내주시면 됩니다.

• 1.5ml 플라스틱 튜브를 사용하고, 뚜껑을 돌려서 닫거나 파라필름으로 밀봉하십시오.
• 튜브에 라벨을 명확하게 붙여주세요.
• 최소 용량: 15µL
• 최소 농도: 100ng/µL

샘플은 다음 주소로 보내주십시오:

폴리플러스-트랜스펙션
제작팀
80 rue du Dr Yersin
59120 루스
프랑스

샘플의 참조 서열을 알고 계시면 당사 플랫폼에 입력해 주십시오.

저희는 두 가지 수준의 서비스를 제공합니다: 및 .

• 구매 및 샘플 수령 후 2~3주 이내에 종합적인 결과를 제공합니다. 이 형식을 사용하면 단 하나의 샘플도 시퀀싱할 수 있습니다.
• 구매 주문 및 샘플 수령 후 3영업일 이내에 결과를 보장합니다. 이 서비스는 12개 샘플 단위로 견적을 제공하지만, 결과를 빨리 받아보시려면 12개 샘플 중 일부만 요청하실 수도 있습니다.

샘플 시퀀싱이 완료되면 플라스미드의 전체 서열(.fasta 파일)과 시퀀싱 보고서(.pdf 파일)를 제공해 드립니다. 보고서에는 다음 내용이 포함됩니다.

• 염기서열 분석 결과를 시각적으로 표현한 것으로, 커버리지와 참조 염기서열과의 차이점(있는 경우)을 함께 보여줍니다.
• 참조 서열과 비교하여 관찰된 변이(삽입, 삭제, 치환)의 위치 및 특성.
• 샘플에 포함된 세균 gDNA와 같은 오염 물질의 비율입니다.

염기서열 분석 보고서와 플라스미드의 전체 염기서열은 귀하의 계정에서 확인하실 수 있습니다.

저희는 분석을 수행합니다.

저희는 단일 샘플이라도 NGS 분석을 진행합니다. 샘플 수에는 제한이 없으며, 최대 150개의 샘플을 동시에 시퀀싱할 수 있습니다.

현재 저희는 Illumina 기술(짧은 판독, 150bp)을 사용하여 NGS를 수행하고 있습니다.

저희는 컨설팅 서비스를 제공합니다. 시퀀싱 결과에 대한 특정 생물정보학 분석이 필요하시면 문의해 주세요.

온라인 pDNA 서비스 플랫폼은 Mozilla Firefox, Google Chrome 및 Microsoft Edge에서 테스트되었습니다. Opera 또는 Safari와 같은 다른 브라우저에서도 작동하지만 모든 기능에서 완벽한 호환성을 보장할 수는 없습니다.

저희는 귀하께서 현재 진행 중인 프로젝트를 볼 수는 있지만, 특별히 요청하지 않는 한 어떠한 수정이나 제안도 하지 않습니다.

프로젝트 생성과 제출 사이에 시간 제한은 없습니다. 예를 들어, 프로젝트를 저장해 두었다가 몇 달 후에 다시 돌아와 작업을 이어갈 수도 있습니다.

프로젝트를 제출하시면 플라스미드 전문가가 필요한 플라스미드의 수, 복잡성, 필요한 합성 횟수 및 요청된 증폭 규모를 기반으로 견적 제안서를 보내드립니다.

저희 양식을 사용하여 요청을 제출해 주세요. 대략적인 초기 견적을 신속하게 보내드리겠습니다. 요청하신 플라스미드 수량 및 품질 등급을 바탕으로, 맞춤 전략, 단계별 작업 패키지 및 결과물, 일정, 그리고 관련 예산을 포함한 상세 견적서를 작성하여 보내드립니다.

한 배치 생산에 소요되는 표준 소요 시간은 다음과 같습니다.

• 탐색 기간: 3~4주
• 연구 기간: 6주
• GMP 원칙: 5~10주
• GMP: 12주

제공 가능한 플라스미드의 최대 수량은 품질 등급(연구용, GMP 원칙 등급 또는 GMP)에 관계없이 20g입니다. 또한, 디스커버리 등급의 경우 1μg에서 50mg까지의 수량에 대한 pDNA 증폭 서비스도 제공합니다.

플라스미드 생산 프로젝트는 Xpress Biologics에서 제작한 세포 뱅크 또는 고객이 제공하는 세포 뱅크를 사용하여 수행할 수 있습니다. 생물안전성을 위해 고객이 제공하는 세포 뱅크에는 박테리오파지가 없음을 증명하는 CoA(분석증명서)가 첨부되어야 합니다.

고품질(HQ) 플라스미드는 전임상 시험용 의약품 원료 또는 전임상 및 임상 1/2상 시험의 출발 물질로 사용할 수 있습니다. 생산 및 정제된 플라스미드는 물리적 상태, 정체성, 함량, 순도/불순물 및 안전성과 관련된 속성을 포괄하는 완벽한 품질 관리 절차를 통해 특성화됩니다.

플라스미드를 모든 임상 시험의 의약품 원료로 사용하거나 2/3상 임상 시험의 출발 물질로 사용할 경우 GMP 등급이 필수적입니다. ("개요" 섹션의 그림 참조). 생산 및 정제된 플라스미드는 물리적 상태, 정체성, 함량, 순도/불순도 및 안전성과 관련된 속성을 포괄하는 완벽한 품질 관리 세트를 사용하여 특성화됩니다. (아래 표 참조: 플라스미드의 다양한 품질 등급에 대한 품질 관리 목록). 대부분의 시험은 공정서에 수록되어 있으므로, HPLC를 이용한 플라스미드 구조 분석과 같은 특정 시험에 대한 검증이 필요하며, Xpress Biologics에서 이를 제안합니다.

AAV 벡터에 존재하는 역방향 말단 반복 서열(ITR)은 벡터 생산 과정에서 게놈 복제 및 패키징을 유도하는 데 필요합니다. ITR 서열은 일반적으로 헤어핀 구조를 형성하여 플라스미드의 전하 밀도를 변화시키고, 결과적으로 크로마토그래피 거동을 다르게 하여 정제 효율을 저하시킬 수 있습니다. 이는 ITR 서열의 존재로 인해 초나선형(SC) 형태와 개방형 원형(OC) 형태의 전하 밀도가 유사해지기 때문입니다. 따라서 두 이성질체를 성공적으로 분리하고 규격에 부합하는 SC 형태의 회수율(95% 이상)을 달성하기 위해 크로마토그래피 조건을 수정했습니다.

반복 서열(예: LV 벡터의 LTR 서열)의 존재는 증폭 단계에서 재조합 현상을 촉진할 수 있습니다. Xpress Biologics는 이러한 재조합 현상을 방지하면서 산업적 및 경제적 제약 조건에 부합하는 수확 시 플라스미드 수율을 확보하는 발효 공정을 개발했습니다. 또한, 당사의 분석 방법은 반복 서열을 포함하는 플라스미드의 전체 염기서열을 분석할 수 있으므로 잠재적인 재조합이 발생하지 않았음을 확인할 수 있습니다.

지난 3년간 Xpress Biologics는 LV 생산 전용 플라스미드 제조 프로젝트를 약 30건 진행했으며, 이는 연구 개발, 본사 및 GMP 등급 배치를 포함하여 50개 이상의 배치에 해당합니다.

지난 3년간 Xpress Biologics는 AAV 생산 전용 플라스미드 제조 프로젝트를 약 20건 진행했으며, 이는 연구 개발 및 고품질 등급 배치를 포함하여 총 30개 배치에 해당합니다.

Xpress Biologics는 플라스미드 서열에 존재하는 긴 폴리(A) 꼬리를 고려하여 제조 공정(주로 발효)을 조정했으며, 최대 120개 뉴클레오티드 길이의 꼬리를 성공적으로 생산 및 정제할 수 있습니다. 고객이 선형화를 요청할 경우, 효소 사용량을 최소화하고 생산 비용을 절감하기 위해 소화 조건을 최적화하는 타당성 조사를 제안합니다.

Xpress Biologics가 개발한 정제 프로토콜(뉴클레아제 미사용)을 통해 높은 순도를 달성했기 때문에, 플라스미드는 -20°C 또는 -80°C에서 냉동 보관 시(3년 이상 안정성 유지)뿐만 아니라 4°C 또는 실온에서 보관 시에도 탁월한 안정성을 보입니다. 또한, Xpress Biologics는 최근 수년간 축적된 풍부한 경험을 바탕으로 장기 안정성을 보장하는 데 적합한 제형 완충액에 대한 자문을 고객에게 제공할 수 있습니다. 예를 들어 신약 허가 신청을 위한 서류 제출이 필요한 경우, ICH 가이드라인에 따라 장기 안정성 연구를 진행할 수 있습니다.

네, 저희는 혁신적인 조립 기술(e-Zyvec^®) 기반의 플라스미드 엔지니어링 서비스를 제공합니다. 저희의 온라인 소프트웨어와 전담 플라스미드 전문가가 고객님의 응용 분야에 적합하고 대규모 생산 요구 사항과 호환되는 플라스미드 특성을 정의하는 데 도움을 드릴 수 있습니다.