핵산전달감염 시약 및 pDNA 제품에 대한 자주 묻는 질문

FectoVIR-AAV는 AAV 생산 공정에서 원료로 사용되는 형질전환 시약입니다. FectoVIR-AAV는 다른 상용 형질전환 시약보다 높은 생산성을 제공하고 전체 생산 비용을 절감합니다.

FectoVIR-AAV 구조는 기밀이며 Polyplus에서 특허를 출원했습니다. PEIpro, FectoVIR-AAV, FectoVIR-LV는 분자 구조와 제형 측면에서 모두 다릅니다.

유효기간은 '내 싸토리우스'에서 확인할 수 있는 분석 성적서에 표시되어 있습니다.

우리는 현탁 HEK-293 유래 세포주인 HEK-293T, HEK-293F, Expi293, VPC, VPC2.0 등에서 FectoVIR-AAV를 성공적으로 사용했습니다. 고객들은 FectoVIR-AAV가 여러 상용 및 자체 개발 현탁 HEK-293 서브클론에서 잘 작동한다고 확인했습니다.

사내에서 우리는 AAV-2, AAV-5, AAV-8 및 AAV-9를 생산합니다. 더 많은 혈청형이 고객들에 의해 테스트되었으며, 비교 가능한 수율 개선을 보였습니다.

FectoVIR-AAV는 부유 및 부착성 시스템에서 바이러스 역가 측면에서 뛰어난 개선을 보입니다.

렌티바이러스 생산의 경우, 부착성 및 부유 세포 배양 시스템 모두에서 현재 가장 우수한 제품인 FectoVIR-LV를 권장합니다.

FectoVIR-AAV GMP는 검증되고 무균의 제조 공정을 보장하는 ICH Q7 GMP 파트 II 가이드라인을 준수하여 제조됩니다. 또한 FectoVIR-AAV GMP는 IND를 지원하고 제품의 완전한 추적성을 보장하기 위한 포괄적인 규제 문서와 함께 제공됩니다. 핵산전달시약을 제약 가이드라인에 따라 제조하면 위험을 줄이고 환자 안전을 보장하는 데 도움이 됩니다.

FectoVIR-LV는 유전자 변형 세포 치료제(CAR-T, CAR-NK, 유전자 변형 줄기세포 치료제 등)에 사용되는 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 차세대 핵산전달시약입니다. 이 새로운 분자를 개발하는 데 3년이 소요되었으며, 최종적으로 LVV 역가를 높일 수 있는 핵산전달 솔루션을 찾았습니다.

유효기간은 '내 싸토리우스'에서 확인할 수 있는 분석 성적서에 표시되어 있습니다.

FectoVIR-LV GMP는 현재 개발 중입니다.

PEIpro는 부착성 및 부유성 세포에서 혈청 포함 또는 혈청 무첨가 배지로 대규모 바이러스 생산(주로 AAV 및 LV, 그 외 다른 바이러스)을 위해 특별히 개발되었습니다. PEIpro는 치료용 바이러스 생산에 적합한 광범위한 품질관리와 함께 제공됩니다.

PEIpro, PEIpro-HQ 및 PEIpro-GMP는 분자량이 독점 정보인 선형 폴리에틸렌이민(PEI)으로 구성되어 있습니다. 체외에서 최적의 DNA 전달과 최저 세포독성을 위해 선형 PEI를 선택하기 위한 광범위한 최적화 실험이 수행되었습니다.

PEIpro는 선형 PEI의 수용액으로 제공됩니다.

PEIpro는 형질전환 효율에 영향을 주지 않고 우발적인 동결/해동 주기를 거칠 수 있습니다. 그러나 장기 안정성을 보장하기 위해 장기 보관 시 5°C ± 3°C에서 시약을 보관하는 것을 권장합니다.

유효기간은 '내 싸토리우스'에서 확인할 수 있는 분석 성적서에 표시되어 있습니다.

바이러스 벡터의 유형에 따라 다른 HEK-293 세포 아형이 선호됩니다. 예를 들어 아데노바이러스와 AAV 바이러스 생산에는 HEK-293, AAV와 렌티바이러스 생산에는 HEK-293T와 HEK-293FT가 사용됩니다. PEIpro는 부착성 및 부유성 HEK-293 세포 아형 모두에서 바이러스 생산에 적합합니다.

HYPERFlasks™와 HYPERstacks™(Corning)와 같은 다층 플라스크 또는 iCELLis 바이오리액터(Pall)와 같은 고정층 배양 시스템을 포함한 다양한 배양 용기가 부착성 HEK-293 세포에서 PEIpro 사용과 호환됩니다. 부유성 HEK-293 세포의 바이러스 생산의 경우 대형 쉐이커 플라스크 또는 바이오리액터를 사용할 수 있습니다.

많은 다른 핵산전달 시약과 달리, 당사의 모든 제품은 혈청과 호환되므로 복합체를 혈청 포함 배지에 직접 세포에 첨가할 수 있습니다.

당사 제품 중 어떤 것도 항생제 존재로 인해 핵산전달 효율이 영향받지 않습니다. 예를 들어, 각 새 배치에 대한 일상적인 검증 프로토콜은 항상 혈청 및 항생제 포함 배지에서 수행됩니다.

많은 세포 배양액이 포유류 세포를 성장시키고 유지하는 데 사용되며, 일부는 양이온성 중합체/지질 매개 트랜스펙션을 억제할 수 있습니다. 트랜스펙션과 관련된 세포 배지 호환성에 대한 자세한 정보는 당사 전달 전문가에게 문의하십시오.

세대 번호는 형질전환 성능에 영향을 미칩니다. 세포가 오랜 기간 배양되었다면 (20세대 이상), 형질전환 효율이 감소하므로 액체 질소에서 보관된 새로운 튜브의 세포로 새 배양을 시작하는 것을 권장합니다. 반면에, 형질전환 실험을 시작하기 전에 해동 후 최소 2회 계대배양을 해야 합니다.

세포 밀도는 형질전환 성능에 영향을 미칩니다. 형질전환 시점의 권장 밀집도는 형질전환 시약에 따라 다를 수 있습니다. 형질전환 당일 예상되는 밀집도를 얻기 위해 시약에 권장된 세포 파종 수를 참조하십시오.

이 비율은 트랜스펙션 시약 마이크로리터당 마이크로그램 단위의 핵산 양에 해당합니다. 예를 들어, 1:2 비율은 트랜스펙션 시약 2μl당 1μg의 핵산을 의미합니다.

There are several parameters that can be changed to improve the transfection efficiency. If you are looking for some optimization, contact our Scientific Support team at support@polyplus-transfection.com. 

jetOPTIMUS는 부착성 세포의 일상적인 형질전환을 위해 권장되는 시약으로, 까다로운 세포에도 적합합니다. 여러 플라스미드의 공동 전달 및 소규모 바이러스 생산에 매우 적합합니다. jetOPTIMUS를 이용한 형질전환은 세포 생존율과 형태에 최소한의 영향을 미치면서 높은 형질전환 효율과 유전자 발현을 제공합니다.

jetPRIME는 다양한 부착성 세포주에서 효과적이고 재현 가능한 DNA 및 siRNA 형질전환을 보장하는 다목적 형질전환 시약입니다. 이 다재다능한 시약은 DNA와 siRNA의 공동 형질전환에도 완벽합니다. jetPRIME를 이용한 형질전환은 핵산의 적은 양만 필요하므로 매우 낮은 세포독성을 나타냅니다.

jetPEI 형질전환 시약은 자동 또는 수동 HTS(고처리량 스크리닝)에 특히 적합하며, 역방향, 배치, 전방향 등 세 가지 프로토콜을 제공합니다. jetPEI는 매우 재현 가능한 결과를 제공하며, DNA/jetPEI 복합체는 최대 4시간 동안 안정적입니다.

다중 플라스미드의 공동 형질주입을 위해, jetOPTIMUS 프로토콜에 표시된 최대 DNA 양을 초과하지 않도록 권장합니다. 각 플라스미드에 사용할 비율은 플라스미드의 크기, 플라스미드 구조 및 각 플라스미드의 예상 발현 수준에 따라 달라집니다. 각 플라스미드는 웰당 총 DNA 양의 최소 10%를 차지해야 합니다.

플라스미드 DNA/siRNA 공동 형질주입을 위해 jetPRIME 시약을 권장합니다. 웹사이트에서 제공하는 DNA 및 siRNA 공동 형질주입을 위한 표준 프로토콜을 참조하십시오.

DNA/ssODN 공동 형질주입(단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드)의 경우 동일한 프로토콜을 적용할 수 있습니다.

jetOPTIMUS는 원발세포(상피, 간세포, 내피, 섬유아세포 등), 줄기세포(배아, 중간엽, 유도 다분화능), 암세포주 등 핵산전달감염이 어려운 세포에 DNA 핵산전달감염에 매우 적합합니다.

그러나 림프구 세포주, 섬유아세포, 신경세포와 같은 일부 부유 및 원발세포는 핵산전달감염이 매우 어렵습니다. DNA Polyplus는 mRNA 전달을 위해 설계된 jetMESSENGER라는 지질 기반 핵산전달감염 시약을 개발했습니다. 이 시약은 림프종 및 혈액세포주, 신경세포, 다양한 원발세포를 포함한 핵산전달감염이 어려운 다양한 세포에서 높은 효율을 보였습니다. DNA와 비교하여 mRNA 핵산전달감염은 핵산전달감염된 세포의 비율이 높고, 핵산전달감염 후 단백질 발현이 더 빠르며, 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 달리 게놈 삽입 위험이 없습니다.

jetOPTIMUS 또는 jetPRIME을 사용하여 최적의 핵산전달감염 효율을 얻으려면 복합체 형성 시간을 10분 이내로 유지하는 것이 좋습니다. 따라서 고처리량 스크리닝과 같이 더 긴 배양 시간이 필요한 어플리케이션의 경우, jetPEI를 사용하는 것이 좋습니다. jetPEI/DNA 및 DNA/jetOPTIMUS 복합체는 최대 4시간 동안 안정적입니다.

이러한 시약을 사용한 DNA 핵산전달감염에는 크기 제한이 없습니다. 다만, 동일한 양의 DNA에 대해 대형 DNA 구조체의 유전자 복사 수가 작은 플라스미드보다 낮을 수 있다는 점에 유의해야 합니다.

jetOPTIMUS는 DNA와 상호작용하여 양전하 복합체를 형성하고, 이는 엔도사이토시스를 통해 세포 내부로 침투합니다. 엔도좀은 프로톤 스펀지 메커니즘을 통해 세포질에 DNA를 방출합니다(Behr, Chimia 1997). 플라스미드는 대부분 핵막이 사라지는 유사분열 중에 핵에 도달합니다. 이러한 이유로 세포 분열 속도가 느린 원발 세포 또는 세포주는 일반적으로 형질전환이 어렵습니다.

INTERFERin은 siRNA 형질전환에 가장 적합한 시약이며, 1 nM의 적은 양의 siRNA로도 작동합니다.

jetPRIME는 고농도(10~50 nM 사용)의 siRNA 전달에 적합하며 DNA/siRNA 공동 전달 시 권장됩니다.

또한, siRNA 또는 miRNA를 생체 내에서 전달하려면 in vivo-jetPEI가 가장 적합한 시약입니다.

shRNA는 플라스미드 벡터나 올리고뉴클레오티드로 형질전환될 수 있습니다. shRNA가 올리고뉴클레오티드로 형질전환되는 경우 INTERFERin이 권장됩니다. 그러나 shRNA를 발현하는 벡터를 사용하는 경우 jetOPTIMUS jetPRIME가 더 적합한 시약입니다. shRNA의 생체 내 전달을 위해서는 in vivo-jetPEI 사용을 권장합니다.

우리의 –jetPEI는 모든 동물 모델에 올리고뉴클레오타이드를 전달하는 데 적합한 강력한 중합체 기반 시약입니다. 프로토콜은 기존 형질주입과 유사합니다: 핵산과 시약을 혼합하여 동물에 투여하면 됩니다.

단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 전달을 위해 jetPRIME 시약 사용을 권장합니다.

플라스미드 DNA 및 ssODN 공동 형질주입(예: CRISPR/Cas9 어플리케이션)의 경우, DNA 및 siRNA 공동 형질주입을 위한 표준 프로토콜을 참조하십시오.

여러 유형의 분자가 부적절하게 miRNA로 불립니다. miRNA라는 용어는 다음을 지칭할 수 있습니다:

모방 miRNA: 이들은 구조적으로 siRNA와 유사하지만 동일하지 않으며 INTERFERin으로 형질전환할 수 있습니다. miRNA 인코딩 플라스미드: 이 분자는 jetOPTIMUS를 사용하여 형질전환할 수 있습니다. 항-miRNA: 이는 내재된 마이크로RNA를 특이적으로 결합하고 억제하도록 설계된 단일 가닥 핵산이며, INTERFERin을 사용하여 형질전환할 수 있습니다.

동일한 양의 형질전환된 올리고뉴클레오타이드의 경우, 전달된 복사본 수는 올리고뉴클레오타이드 크기에 따라 다릅니다 (더 긴 올리고뉴클레오타이드: 더 적은 복사본, 더 짧은 올리고뉴클레오타이드: 더 많은 복사본). 따라서 올리고뉴클레오타이드 양을 그에 맞게 조정해야 합니다.

시험관 내 mRNA 핵산전달감염의 경우, jetMESSENGER가 우리의 선택 시약입니다. 실제로 jetMESSENGER 프로토콜은 간단합니다: 시약은 즉시 사용 가능하며 다양한 부착성 및 부유성 세포주의 표준 배양액(혈청 유무 및 항생제 포함)과 호환됩니다. jetMESSENGER는 매우 온화한 과정을 통해 작동하며, 쥐 피질 뉴런, 인간 간 암세포, 마우스 배아줄기세포 등 핵산전달감염이 어려운 다양한 세포의 세포 생존성과 전반적인 세포 형태를 유지합니다.

생체 내 mRNA 전달의 경우, in vivo-jetRNA+가 최고 수준의 시약입니다. in vivo-jetRNA+는 생체 내 mRNA 전달을 위해 특별히 개발된 사전 형성된 리포좀으로 구성된 즉시 사용 가능한 핵산전달감염 시약입니다. 이 시약은 다양한 동물 모델(마우스, 쥐 등)에서 전신 주입 경로를 통해 단일 또는 다중 장기를 대상으로 사용할 수 있습니다. in vivo-jetRNA+를 이용한 mRNA 전달은 사용자 친화적이며, 간단한 2단계 프로토콜을 가지고 있고 지질 나노입자(LNPs)와 비교해 매우 효율적입니다. in vivo-jetRNA+는 백신/면역화, 항암 연구, CRISPR/Cas9 방법을 이용한 게놈 편집 또는 단백질 대체에 사용될 수 있습니다.

LipidBrick 제품군을 통해 우리는 지질 나노입자(LNPs) 제조를 위한 양이온성 지질의 범위도 제공합니다. 이러한 활성 지질은 mRNA 분자를 보호하고 LNPs의 핵산전달감염 능력에 중요한 역할을 합니다. 중요하게도, 이미다졸륨 극성 머리기를 기반으로 하는 LipidBrick은 LNPs의 효능과 생체분포 측면에서 현재 LNP 응용 범위를 확장하여 LNPs에 전체적인 양전하를 추가합니다: 이는 이온화 가능한 지질 기반 LNPs에 비해 간에 축적을 줄이면서 폐와 비장으로의 mRNA 전달을 더욱 증가시킵니다. 또한 LipidBrick® 제품군 내에서 LipidBrick IM21.7c는 jetMESSENGER 및 in vivo-jetRNA®+의 제조에 사용되는 양이온성 지질(활성 지질)로, 즉시 사용 가능한 시약과 귀하의 필요 및 응용에 맞춘 LNP 제조 간의 원활한 전환을 허용합니다.

mRNA는 상업적으로 이용 가능한 솔루션(예: New England Biolabs의 HiScribe™ 키트)을 사용하여 DNA 주형으로부터 시험관 내 전사(IVT)할 수 있거나, Trilink, Eurofins, Aldevron 등 다양한 올리고뉴클레오티드 공급업체를 통해 '맞춤 제작'으로 구매할 수 있습니다.

당사의 D-zyvec 플랫폼을 통해 귀하의 mRNA 요구사항에 맞게 특별히 설계되고 선형화된 DNA 주형을 제작할 수 있습니다. 자세한 정보는 과학 지원팀에 문의해 주시기 바랍니다(문의 바랍니다).

참고로, DNA 주형은 선형화되어야 하며, 전사될 서열의 상류에 T7 또는 SP6와 같은 RNA 중합효소 촉진자 영역을 포함해야 합니다. 이는 센스 RNA의 경우 5' 방향, 안티센스 RNA의 경우 3' 방향입니다. 필요한 경우, 최소 촉진자 서열을 포함하는 프라이머를 사용하는 PCR을 통해 전사될 서열 상류에 RNA 중합효소 촉진자 영역을 추가할 수 있습니다.

일반적으로 시험관 내 전사 후 mRNA 정제는 필요하지 않으며, RNA 오염물질이 최소여야 합니다. 필요한 경우, 페놀-클로로포름 추출/에탄올 침전, 염화리튬 침전, 겔 정제 방법, 그리고 여러 상용 mRNA 분리 키트 등 여러 방법이 적합합니다.

mRNA 크기 자체에는 제한이 없습니다. mRNA 합성 키트는 보통 0.3~5kb 크기의 mRNA 전사체(10-150 kDa 단백질 크기에 해당)에 최적화되어 있다는 점을 유의해야 합니다. 따라서 더 짧거나 긴 mRNA 전사체의 경우, 유사한 높은 수율을 얻기 위해 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.

DNA 형질전환과 비교하여, jetMESSENGER 및 in vivo–jetRNA+를 이용한 mRNA 매개 형질전환은 유사한 기간 동안 프로모터에 의존하지 않는 더 통제된 유전자 발현을 가능하게 합니다. 활발히 분열하는 세포에서 mRNA 발현은 형질전환 후 1~4일 사이에 더 현저하고 안정적으로 관찰됩니다. 느리게 분열하거나 분열하지 않는 세포에서는 예를 들어 일차 신경세포에서 최대 7일까지 mRNA 발현이 안정적일 수 있습니다.

내재적 진핵 mRNA 합성 중에, 7-메틸구아노신 CAP이 신생 전사체의 5' 말단에 추가되어 분해로부터 보호하고 번역 속도를 높입니다. 신생 mRNA의 3' 말단에 있는 폴리A 꼬리는 추가로 분해로부터 보호하고 성숙한 mRNA의 핵 수출에 역할을 합니다. 따라서 기존 mRNA 합성 키트는 보통 5' 캡 아날로그와 3' 폴리A 꼬리의 통합을 통해 mRNA 안정성을 개선하는 솔루션을 제공합니다. 또한 5-메틸시토신 및/또는 N6-메틸아데닌과 같은 mRNA 서열 내 특정 염기 변형을 안정성 증가 및 면역원성 감소를 위해 통합할 수 있습니다. 올리고뉴클레오티드 제공업체에서 주문한 맞춤형 mRNA는 안정성 증가를 위해 의사-우리딘과 같은 특정 변형으로 주문할 수 있습니다.

RNA 전사체의 안정성을 높이는 것이 항상 필요한 것은 아닙니다. 예를 들어, 일부 바이러스 RNA 전사체는 감염성 바이러스를 복제하거나 생성하기 위해 캡핑 및 폴리아데닐화될 필요가 없습니다.

mRNA 전달은 일시적 발현에 적합하지만, 안정적인 클론 생성에는 적합하지 않습니다. mRNA는 세포 게놈에 통합될 수 없어 안정적인 클론 생성을 방지하지만, 숙주 세포의 게놈을 수정하지 않는다는 장점이 있습니다.

CRISPR 매개 유전자 편집은 형질전환을 사용하여 타겟 세포에 가이드 RNA와 Cas9 단백질을 전달해야 합니다. 검증된 방법은 플라스미드 DNA로 가이드 RNA와 Cas9 단백질을 전달하는 것이며, 이를 위해 최신 기술인 jetOPTIMUS를 추천합니다. jetOPTIMUS는 가장 광범위한 1차 세포와 세포주에서 최고의 유전자 편집 효율을 보장합니다.

전통적인 플라스미드 기반 방법의 오프타겟 효과가 우려될 때 DNA 비의존적 유전자 편집 방법을 고려할 수 있습니다. mRNA로서 gRNA와 Cas9 단백질을 전달하는 것은 부착성 및 부유성 세포 모두에서 강력한 유전자 편집 효율을 달성하기 위한 가장 흔한 DNA 비의존적 대안입니다.

완전한 RNA 접근법 - mRNA로 인코딩된 Cas9 및 가이드 RNA의 경우 - jetMESSENGER® 형질전환 시약을 추천합니다.

마지막으로, 혼합 접근 방식 - RNA로서의 Cas9 및 gRNA를 인코딩하는 플라스미드 DNA의 경우, 가장 적합한 시약은 jetPRIME입니다.

생체 내 CRISPR 매개 유전자 편집의 경우, 저희의 선택 시약은 in vivo-jetPEI입니다. 여러 그룹에서 마우스의 유전자 편집을 위해 in vivo-jetPEI를 사용한 결과를 발표했습니다:

Zuckermann, M. & al. (2015). .

허 에스 & 공저자들 (2016)

다카오 T. . 미국 국립과학원 회보 28579-28581

팔라레스-마스미티아 M. Nat Commun 7071

맥패든 T. 영양 신경과학 1-13

in vivo-jetPEI는 DNA, siRNA, 모방 miRNA 및 기타 올리고뉴클레오티드와 같은 모든 유형의 핵산을 생체 내에서 전달하는 데 적합한 즉시 사용 가능한 중합체 기반 핵산전달시약입니다.

in vivo-jetRNA+는 생체 내에서 mRNA를 전달하기 위해 특별히 개발된 즉시 사용 가능한 지질 기반 핵산전달시약입니다.

LipidBrick는 지질 나노입자(LNPs)의 제조에 전념하는 양이온성 지질 제품군입니다. 이러한 활성 지질은 mRNA 분자를 보호하고 LNPs의 형질전환 능력에 중요한 역할을 합니다.

in vivo-jetPEI는 마우스에서 핵산 전달에 이상적입니다. 그러나 프로토콜이 매우 쉽고 다재다능해서 쥐, 모기, 새우, 기니피그, 마카크 등 많은 다른 종에 적용되었습니다.

in vivo-jetRNA+의 경우, 매우 간단한 2단계 프로토콜을 가진 즉시 사용 가능한 시약입니다. 2022년 말에 출시된 비교적 최근의 시약으로, 지금까지 마우스와 쥐에서 사용되었습니다.

프로토콜을 귀하의 동물 모델에 맞추기 위해 저희 과학 지원팀에 연락해 주시기 바랍니다 연락처는 다음과 같습니다

in vivo–jetRNA+ 및 in vivo–jetPEI는 전신 및 국소 핵산 전달에 적합합니다. 정맥 주사(꼬리 정맥 및 안와 뒤), 복강 내 주사, 종양 내 주사, 뇌 내 주사, 비강 내 주입 등 여러 투여 방법이 성공적으로 테스트되었습니다.

전달 절차는 표적 장기에 크게 의존합니다. 투여 경로에 따라 in vivo-jetRNA+ 또는 in vivo-jetPEI 매개 유전자 발현은 뇌, 간, 췌장, 비장, 신장, 심장, 방광, 피부, 망막 등에서 관찰됩니다.

중요하게도, 이미다졸륨 극성 머리기를 기반으로 하여 LipidBrick은 LNP에 전체적인 양전하를 추가함으로써 현재 LNP 응용의 스펙트럼을 효능과 생체분포 측면에서 확장합니다. 이는 이온화 가능한 지질 기반 LNP와 비교하여 간에 축적되는 양은 줄이면서 폐와 비장으로 mRNA 전달을 더욱 증가시키는 것을 의미합니다.

더 자세한 조언을 위해 Scientific Support 팀에 문의해 주시기 바랍니다.

핵산과 in vivo-jetPEI 사이에 형성된 복합체는 시간이 지나도 응집체를 형성하지 않으며, 상온 또는 37°C에서 최소 4시간, 4°C에서 최대 7일 동안 안정적이다.

반면에 mRNA/in vivo-jetRNA+ 복합체는 상온에서 최대 72시간, 4°C에서 최대 1개월 동안 안정적이다.

따라서 복합체를 미리 준비할 수 있으며, 이는 지속적 전달을 위한 삼투압 펌프 사용과 호환된다.

싸토리우스는 미국 및 유럽 현행 우수제조관리기준(cGMP)을 준수하여 제조된 GMP 등급의 in vivo-jetPEI를 제공하며, 이는 1상부터 3상까지 임상시험에서 인체에 사용하기에 적합합니다. 이 시약은 전 세계적으로 점점 더 많은 치료제에 사용되고 있습니다.

현재 in vivo-jetRNA+는 GMP 등급으로 제공되지 않지만, 고객 요청에 따라 GMP 등급으로 개발할 가능성이 있습니다(12~18개월의 개발 기간과 최소 주문 수량 필요).

FectoPRO는 일시적 유전자 발현 시스템에서 최상의 결과를 얻고자 하는 과학자들을 위해 개발된 바이오제조용 시약으로, 포유류 세포에서 단백질 생산에 최적의 선택입니다. FectoPRO는 다양한 배지에서 배양되는 CHO 및 HEK-293 세포주에서 최고의 형질전환 효율과 단백질 수율을 보장합니다. 또한 FectoPRO는 뛰어난 세포 생존율, 재현성 및 결과의 일관성을 나타냅니다. FectoPRO는 상용 시약 중 가장 우수한 성능을 보이며, 적은 양의 DNA와 시약으로 (어떤 규모에서든) 포유류 바이오생산 공정을 최적화할 수 있게 해줍니다.

대규모 또는 매우 대규모 실험의 경우, HEK-293 세포에서 매우 효과적이고 비용 효율적인 PEIpro를 고려해볼 수 있습니다.

부착성 시스템에서 단백질 생산의 경우, PEIpro 또는 jetOPTIMUS를 고려할 수 있습니다.

FectoPRO는 FectoPRO 부스터 없이 사용할 수 있지만, 적은 양의 DNA로 높은 단백질 수율을 얻고 싶다면 사용을 권장합니다.

FectoPRO는 일반 및 고밀도 세포 시스템에서 아주 잘 작동합니다. FectoPRO는 더 짧은 시간에 더 높은 수율을 달성할 수 있게 해줍니다 - 재조합 단백질 생산을 위해 7일 또는 12일의 세포 성장을 기다릴 필요가 없습니다.

FectoCHO 발현 시스템 프로토콜에 따르면, 배지와 함께 사용할 경우 최적의 DNA 양은 세포 배양액 1mL당 0.8 µg DNA입니다. FectoPRO를 다른 배지와 함께 사용하는 경우 지침을 위해 FectoPRO 프로토콜을 참조하십시오. 그러나 FectoCHO™ CD 발현 배지와 FectoPRO 강력한 형질전환 시약의 상승 효과로 더 나은 단백질 생산 수율을 얻을 수 있다는 점에 유의해야 합니다.

FectoPRO와 PEIpro 모두 현탁 및 무혈청 배지에서 HEK293 세포와 함께 훌륭하게 작동하는 것으로 입증되었습니다. 하지만 어플리케이션에 따라 다릅니다: FectoPRO는 단백질 생산에, PEIpro는 바이러스 생산에 사용됩니다.

아니요, FectoCHO™ 발현 시스템 키트는 FectoCHO™ CD 발현 배지에 세포를 적응시키고 FectoPRO 형질전환 시약을 사용하여 형질전환을 수행하는 데 완벽하게 적합하므로 배지와 형질전환 시약을 별도로 구매할 필요가 없습니다. 실제로 FectoCHO™ 발현 시스템 키트(참조# 101000011)에는 1L의 배지와 1mL의 형질전환 시약이 포함되어 있어 세포 적응부터 단백질 생산까지 전체 실험을 수행하기에 완벽한 비율입니다. 가격 문의는 언제든 연락 주시기 바랍니다.

사용하는 배지에 따라 1mL의 FectoPRO로 500mL에서 1L의 배양액을 형질전환할 수 있습니다.

ExpiCHO™ 세포에서 FectoCHO 발현 시스템이나 ExpiCHO™ 발현 시스템을 사용할 경우 mL당 DNA 양은 동일합니다. 그러나 FectoCHO를 사용하면 더 낮은 비용으로 최대 2배의 단백질 생산 수율을 얻을 수 있다는 점을 명심하세요.

FectoCHO CD 배지는 ExpiCHO 세포의 배양 및 일시적 단백질 발현에 사용할 수 있습니다. 그러나 플러그 앤 플레이 시스템이 아니라는 점에 유의해야 합니다. 예비 적응 및 최적화 단계가 필요합니다.

지질 나노입자(LNP)는 임상적으로 승인된 유일한 비바이러스성 RNA 전달체이다. 최근 코로나바이러스 발생 이후 mRNA 백신의 성공으로 그 안전성이 입증되었다. COVID-19 백신은 제형의 용이성, 보호 특성, 대용량 적재 능력으로 인해 LNP를 신속하게 채택했다. LNP는 현재 백신 이외의 인체 내 mRNA 치료제 개발을 가속화하고 있다.

mRNA-LNP의 생체분포와 안정성을 개선하고 독성을 줄이기 위해서는 추가 개발이 여전히 필요하다. LNP 제형 내 이온화 가능한 양이온성 지질은 어떤 장기에 형질전환이 일어나는지, mRNA 전달 효율성 및 분해성에 영향을 미친다. Polyplus는 LNP 제형에 사용되는 LipidBrick이라는 양이온성 지질 범위를 개발했다. 이러한 지질은 물리화학적 특성을 조절하고 제형화된 LNP의 후속 효능 및 생체분포에 영향을 미치면서 mRNA 안정성을 개선할 수 있다.

We deliver “discovery grade*” plasmids as circular, double stranded DNA molecules, in a screw-cap plastic tube, re-suspended in 1X AE buffer (miniprep.) or 1X TE buffer (midi, maxi, giga prep.), at room temperature. Please note that we DO NOT provide bacterial stock.

Discovery grade plasmids can be ordered at multiple formats, please inquire for more information.

대규모 또는 고품질 등급의 플라스미드 생산을 위해서는 플라스미드 제조 서비스에 문의하시기 바랍니다

*연구용 등급은 플라스미드가 실험실 모범 사례에 따라 무균 환경에서 생산되지만, 품질관리는 기본적인 품질 및 동일성 시험으로 제한됩니다. 연구용 등급 플라스미드는 연구 용도로 제한되어야 합니다.

품질관리는 기본적인 품질 및 동일성 시험으로 제한됩니다:

• DNA 정량
• A260/280 및 A260/230 측정
• 제한효소 절단 프로파일 (겔 또는 모세관 전기영동)
• 마이코플라스마 및 gDNA 검출을 포함한 전체 플라스미드 염기서열 분석 (NGS)
• 상게 염기서열 분석(필요한 경우)

품질관리 결과는 제품 인도 양식에 문서화됩니다.

연구용 등급 플라스미드의 경우 내독소 수준은 측정되지 않습니다.

대부분의 프로젝트에서는 기존 플라스미드나 다른 DNA 물질을 보내실 필요가 없습니다. 원하는 서열은 DNA 합성(외주)을 통해 생성할 수 있습니다.

그러나 일부 프로젝트에서는 기술적 복잡성을 극복하고, 기술적 연속성을 보장하거나 단순히 비용을 줄이기 위해 DNA 물질(플라스미드 주형 또는 정제된 gDNA만)을 보내야 할 수 있습니다.

이 경우 다음 지침을 따르십시오:

• 1.5 ml 플라스틱 튜브를 사용하고 밀봉하십시오(나사 캡 또는 파라필름)
• 튜브에 명확하게 라벨링하세요
• 최소 부피: 15µL
• 최소 농도: 100ng/µL
• 실온에서 보관하세요. 드라이아이스는 피해주세요.

튜브는 다음 주소로 보내야 합니다:

싸토리우스 폴리플러스 생산팀, 80 rue du Dr Yersin, 59120 Loos, 프랑스

모든 프로젝트를 시작하기 전에 모든 플라스미드 주형은 NGS로 완전히 염기서열 분석됩니다.

gDNA 샘플의 경우 샘플의 무결성을 평가하기 위해 아가로스 겔 사진을 보내주시기 바랍니다.

자체적으로 DNA 합성을 수행하지 않으며, 이는 외주 처리됩니다.

일반 컴피턴트 균주에서 최대 30Kb까지의 플라스미드 조립에 성공했습니다. 더 큰 크기의 플라스미드는 증폭이 어려울 수 있습니다. 하지만 프로젝트에 대규모 플라스미드가 필요한 경우 특정 솔루션을 적용할 수 있으니 문의해 주시기 바랍니다.

우리는 두 가지 수준의 서비스를 운영합니다: 표준 및 프리미엄

• 표준 서비스는 고객 재료로 작업할 수 있으며 5주부터 제공 가능합니다*
• 프리미엄 서비스는 전적으로 DNA 합성에 기반하며 3주 내에 배송될 수 있습니다*.

* 구매 주문 확인 시

수령 즉시, 엔지니어링된 플라스미드가 들어있는 튜브를 간단히 원심분리(벤치 원심분리기)하고 다음 장소에 보관하십시오:

• 단기 보관(<1개월)의 경우 4°C
• 장기 보관의 경우 -20°C

장기 보관을 위해 Polyplus 디스커버리 등급 플라스미드를 분액하고 반복 동결-해동을 피하는 것을 강력히 권장합니다.

여기 제시된 보관 기간은 참고용입니다. 항상 겔 전기영동(변성) 또는 염기서열 분석(서열 무결성)을 통해 장기 보관된 플라스미드의 무결성을 확인해야 합니다.

엔지니어링된 발견 등급 플라스미드는 모든 연구 어플리케이션을 위해 직접 증폭할 수 있습니다.

당사의 박테리아 복제 기원은 기존의 pBR322/pUc 플라스미드와 동일한 방식으로 작동합니다. 따라서 제공자 지침에 따라 모든 균주를 사용할 수 있습니다. 또한 제품 배송 양식에 플라스미드 증폭에 사용한 배양 온도와 항생제 선택을 표시합니다. 참고로, 일반적으로 사용하는 항생제 농도는 암피실린의 경우 100µg/mL, 카나마이신의 경우 30µg/mL입니다.

당사는 자체 제작한 플라스미드 또는 귀하가 보내주신 플라스미드에 대한 pDNA 증폭 서비스를 제공합니다.

증폭은 소규모(수 mg)의 발견 등급 또는 대규모(수 g)의 R&D, 고품질 또는 GMP 등급으로 당사의 플라스미드 제조 서비스를 통해 수행될 수 있습니다.

프로젝트 사양에 달리 명시되지 않은 한, 연구 어플리케이션을 위해 서비스 기반 계약으로 제공되는 모든 엔지니어링된 플라스미드는 당사의 계약 조건에 따라 Polyplus로부터 IP 자유로우며, 다른 어플리케이션의 경우 Polyplus 또는 관련 주체와의 라이선스 계약이 필요할 수 있습니다.

Polyplus 플라스미드 염기서열 분석 서비스는 전체 플라스미드 염기서열 분석에 특화되어 있습니다. 따라서 시작 재료는 정제된 이중 가닥 DNA 플라스미드여야 합니다.

어떤 생물체의 전체 게놈 염기서열 분석은 수행하지 않음을 참고해 주시기 바랍니다.

아래 지침에 따라 샘플을 보낼 수 있습니다:

• 1.5 ml 플라스틱 튜브를 사용하고 밀봉하십시오(나사 캡 또는 파라필름)
• 튜브에 명확하게 라벨링하세요
• 최소 부피: 15µL
• 최소 농도: 100ng/µL

샘플은 다음으로 보내야 합니다:

폴리플러스-트랜스펙션
생산팀
80 루 두 디알 예르생
59120 루
프랑스

알려진 경우, 플랫폼에서 샘플의 참조 서열을 입력해 주세요.

두 가지 수준의 서비스를 운영합니다: 및 .

• 구매 및 샘플 접수 후 2-3주 내에 포괄적인 결과를 제공합니다. 이 형식을 통해 단 하나의 샘플도 시퀀싱할 수 있습니다.
• 구매 주문 및 샘플 접수 후 3 근무일 내에 결과를 보장합니다. 이 형식은 12개 샘플 단위로 견적됩니다. 그러나 결과를 빨리 얻고 싶다면 12개 샘플 배치 중 일부에 대해서만 요청할 수 있습니다.

샘플 시퀀싱 후, 다음 내용을 포함하여 플라스미드의 전체 길이 서열(.fasta 파일)과 시퀀싱 보고서(.pdf 파일)를 제공해 드립니다:

• 참조 서열과 관찰된 차이점 및 커버리지를 포함한 시퀀싱 결과의 시각적 표현
• 참조 서열과 비교하여 관찰된 변이의 위치와 특성(삽입, 결실, 치환)
• 샘플에 포함된 오염물질(예: 박테리아 gDNA)의 비율

플라스미드의 시퀀싱 보고서와 전체 길이 서열은 귀하의 계정에서 확인 가능합니다.

분석을 수행합니다.

단일 샘플에 대해서도 NGS를 수행합니다. 샘플 수에 제한이 없으며, 동시에 150개의 샘플을 시퀀싱할 수 있습니다.

현재 일루미나 기술(단일 리드, 150bp)을 사용하여 NGS를 수행하고 있습니다.

컨설팅을 제공합니다. 시퀀싱 결과에 대한 특정 생물정보학적 분석이 필요하시다면 .

온라인 pDNA 서비스 플랫폼은 Mozilla Firefox, Google Chrome, Microsoft Edge에서 테스트되었습니다. Opera나 Safari와 같은 다른 브라우저에서도 작동하지만, 모든 기능에 대한 완전한 호환성은 보장할 수 없습니다.

현재 작업 중인 프로젝트를 볼 수 있지만, 특별히 요청하지 않는 한 어떠한 변경이나 제안도 하지 않을 것입니다.

프로젝트 생성과 제출 사이에 시간 제한이 없습니다. 예를 들어, 프로젝트를 저장하고 몇 달 후에 다시 돌아와 작업을 계속할 수 있습니다

프로젝트를 제출하면, 플라스미드 전문가가 필요한 플라스미드 수, 복잡성, 필요한 합성 횟수, 요청된 증폭 규모를 기반으로 견적 제안서를 보내드립니다.

저희 . 를 통해 요청서를 제출하세요. 신속하게 초기 대략적인 견적이 발송될 것입니다. 요청된 플라스미드 수량과 품질 등급에 기반하여, 적용된 전략, 연속 작업 패키지 및 결과물, 소요 시간 및 관련 예산을 포함한 상세 견적서가 작성됩니다.

R&D 등급의 배치 제조 소요 시간은 세포은행의 존재 여부에 따라 4~6주 사이입니다. 4개의 플라스미드 세트 제조에는 9~11주가 소요됩니다. 한 개의 GMP 배치 출시를 위해서는 추가로 10주가 필요합니다.

품질 등급(R&D, HQ 또는 GMP)과 관계없이 최대 20g의 플라스미드를 제공할 수 있습니다. 또한 발견 등급으로 최대 50mg까지 pDNA 증폭 서비스를 제공합니다.

플라스미드 생산 프로젝트는 Xpress Biologics에서 생성한 세포은행이나 고객이 제공한 세포은행을 사용하여 수행할 수 있습니다. 생물안전을 위해, 고객이 제공한 은행은 박테리오파지 부재를 증명하는 성적서(CoA)와 함께 제공되어야 합니다.

HQ 등급 플라스미드는 전임상시험의 약물 물질로 사용되거나 전임상 및 임상 1/2상의 시작 원료로 사용될 수 있습니다. 생산 및 정제된 플라스미드는 물리적 상태, 정체성, 함량, 순도/불순물 및 안전성과 관련된 속성을 포함하는 완전한 품질관리 세트를 사용하여 특성화됩니다.

GMP 등급은 모든 임상시험에서 플라스미드를 약물 물질로 사용하고 임상 2/3상의 시작 원료로 사용할 때 필요합니다. (개요 섹션의 그림 참조). 생산 및 정제된 플라스미드는 물리적 상태, 정체성, 함량, 순도/불순물 및 안전성과 관련된 속성을 다루는 완전한 품질관리 세트를 사용하여 특성화됩니다. (아래 표 참조: 플라스미드의 다양한 품질 등급에 대한 품질관리 목록). 대부분의 시험은 공정서에 따릅니다. HPLC를 통한 플라스미드 위상과 같은 특정 시험의 자격은 고려되어야 하며 Xpress Biologics에서 제안합니다.

AAV 벡터에 존재하는 역말단 반복(ITR) 서열은 벡터 생산 중 게놈 복제 및 패키징을 안내하는 데 필요합니다. ITR 서열은 일반적으로 헤어핀 구조를 형성하여 플라스미드의 전하 밀도를 변경하고, 이로 인해 정제 과정의 효율성이 잠재적으로 감소합니다. 이는 ITR 서열의 존재로 인해 슈퍼코일(SC) 형태의 전하 밀도가 개방형 원형(OC) 형태와 유사해지기 때문입니다. 따라서 두 이성체를 성공적으로 분리하고 사양에 부합하는 SC 형태의 비율(>95%)을 회수할 수 있도록 크로마토그래피 조건을 수정했습니다.

반복 서열(예: LV 벡터의 LTR 서열)의 존재는 증폭 단계에서 재조합 사건을 촉진할 수 있습니다. Xpress Biologics는 산업 및 경제적 제약과 호환되는 수확 시 플라스미드 수율을 허용하면서 이러한 재조합 사건을 방지하는 발효 공정을 개발했습니다. 또한, 당사의 분석 방법은 반복 서열을 포함하는 플라스미드의 완전한 염기서열 분석을 가능하게 하여 잠재적 재조합의 부재를 확인할 수 있습니다.

지난 3년간 Xpress Biologics는 LV 생산 전용 플라스미드의 제조 프로젝트를 약 30건 관리했으며, 이는 R&D, HQ 및 GMP 등급 로트를 포함하여 50개 이상의 배치에 해당합니다.

지난 3년간 익스프레스 바이오로직스는 AAV 생산을 위한 약 20개의 플라스미드 제조 프로젝트를 관리했으며, 이는 연구개발 및 본사 등급 로트를 포함해 30개의 배치에 해당합니다.

익스프레스 바이오로직스는 플라스미드 서열의 긴 폴리(A) 꼬리 존재를 고려하여 제조 공정(주로 발효)을 조정했으며, 120개 뉴클레오타이드까지의 꼬리를 성공적으로 생산 및 정제했습니다. 고객이 선형화를 요청할 경우, 제한효소의 양과 따라서 생산 예산을 제한할 목적으로 소화 조건을 최적화하기 위한 타당성 연구를 제안합니다.

Xpress Biologics에서 개발한 정제 프로토콜을 통해 달성된 높은 순도(핵산분해효소 부재)로 인해, 플라스미드의 안정성은 -20 또는 -80°C에 냉동 보관 시(3년 이상 안정성) 뿐만 아니라 4°C 또는 실온에 보관 시에도 탁월한 것으로 보입니다. 또한, 최근 몇 년간 축적된 광범위한 경험을 바탕으로 Xpress Biologics는 장기 안정성 확보를 위한 완충액의 특성에 대해 고객에게 조언할 수 있습니다. 신약 도입을 위한 서류 제출 등을 지원하기 위해 필요한 경우, ICH 가이드라인에 따라 확장된 안정성 연구를 시작할 수 있습니다.

네, 혁신적인 조립 기술(e-Zyvec)을 기반으로 한 플라스미드 엔지니어링 서비스를 제공합니다. 온라인 소프트웨어와 전문 플라스미드 전문가가 귀하의 어플리케이션에 적합하고 대규모 제조 요구사항과 호환되는 플라스미드 특성을 정의하는 데 도움을 드릴 수 있습니다.