생세포 분석을 위한 면역세포 사멸 분석법

Incucyte^® 면역 세포 사멸 분석

환자 자신의 면역 체계가 종양으로부터 신체를 방어하는 역할을 탐구하는 것은 매우 중요합니다. 이러한 항암 반응의 핵심 요소는 세포독성 T 세포 및 자연 살해 세포와 같은 특정 면역 세포가 면역 세포 사멸(ICK) 과정을 통해 악성 세포 사멸을 유도하는 능력입니다. 따라서 시험관 내에서 ICK를 모델링하는 것은 매우 중요합니다. 전통적인 유세포 분석 및 생화학적 분석과 같은 여러 가지 기술이 ICK를 평가하는 데 사용되어 왔지만, 이러한 도구들은 유용함에도 불구하고 세포 간의 역동적인 상호작용에 대한 제한적인 통찰력만을 제공합니다.

시간 소모적인 '최종 시점' 고정 및 염색 프로토콜은 시점별로 하나의 이미지만 생성합니다.
여러 번의 세척 단계가 필요하며 정량화를 위해 방사성 동위원소 또는 항체 표지법을 사용해야 합니다.
시계열 그래프를 구축하기 위해 서로 다른 샘플(분석 웰)의 데이터를 연결해야 하므로 잠재적으로 오류가 발생할 수 있습니다.
환경 통제력 상실은 세포 변화를 초래하여 원치 않거나 오해의 소지가 있는 실험 결과로 이어질 수 있습니다.

Incucyte^® 면역 세포 사멸 분석 키트를 사용하면 면역 세포와 암세포 간의 역동적인 상호작용을 시각화, 정량화 및 이해하는 것이 그 어느 때보다 쉬워집니다. 기존의 면역 또는 면역항암 프로토콜을 보완하고, 세포 건강, 표현형, 하위 집단 및 기능에 대한 비침습적이고 비파괴적인 분석 플랫폼을 활용하여 면역 세포, 항체의 기능 및 사멸 작용에 대한 새로운 통찰력을 얻으십시오.

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생세포 분석 핸드북: 6판

라벨 없는 생세포 이미징 및 분석을 위한 인공지능의 힘이 어떻게 연구를 발전시키고 더 심층적인 발견을 이끌어내는지 알아보세요...

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응용 참고 사항:

생세포 분석과 유세포 분석을 단일 워크플로우로 결합하여 면역 세포 사멸 메커니즘에 대한 추가적인 통찰력을 얻으십시오.

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애플리케이션

Incucyte 면역 세포 사멸 분석법은 실시간 자동 분석과 비간섭성 생세포 시약을 결합하여 조직 배양기 내에서 종양 세포에 대한 면역 세포 매개 사멸을 직접적이고 다중으로 측정할 수 있도록 합니다. 다음과 같은 용도에 적합한 유연한 분석 플랫폼입니다.

세포독성 T 세포 살해
항체 의존성 세포 매개성 세포독성(ADCC)
종양 구형체 모델에서 면역 세포 사멸

Incucyte를 사용하여 촬영한 타임랩스 영상^®생세포 분석 시스템은 기존의 2D 모델과 더욱 복잡한 3D 모델에서 종양 세포 사멸을 실시간으로 시각화하여 보여줍니다.
First, a T cell sub population of PBMCs, activated with anti-CD3 antibody and IL-2, is seen killing target SK-OV-3 tumor cells. Labeling of the SK-OV-3 cancer cells with the Incucyte^® Nuclight Red Lentivirus enables direct counting of viable tumor cell numbers over-time. Addition of the Incucyte^® Caspase-3/7 Reagent enables simultaneous detection of cells undergoing apoptosis (green fluorescence).

다음으로, Incucyte^® 세포별 분석을 사용하여 전체 표적 세포 및 효과기 세포의 증식과 표적 세포의 세포사멸 지수를 정량화하고 그래프로 나타냈습니다. Nuclight Red Ramos 세포를 활성화된 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)와 함께 Incucyte^® Annexin V Green 시약 존재 하에 배양하여 표적 세포 하위 집단의 증식, 표적 세포 사멸 및 면역 세포 증식을 정량화했습니다. 마지막으로, 면역 세포 사멸 스페로이드 모드에서 A549 암세포에 대한 면역 세포의 사멸을 관찰하고 정량화했습니다. Nuclight Red A549 스페로이드를 비활성화 및 활성화된 PBMC와 함께 배양했습니다.

Incucyte^® 면역 세포 사멸 분석 개념

표적 종양 세포는 사용자가 선택한 면역 세포(예: T 세포 또는 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC))와 함께 배양됩니다.
종양 세포 사멸은 Incucyte^® Caspase-3/7 Green 또는 Caspase-3/7 Red 시약이나 Incucyte^® Annexin V Red 또는 Green 시약을 배양액에 첨가하여 직접 실시간으로 측정할 수 있습니다.
자동 이미지 분석을 통해 종양 세포 사멸을 선택적으로 정량화할 수 있습니다. (선택 사항: Incucyte^® Nuclight 라벨링 시약을 사용하여 표적 세포를 라벨링하면 종양 세포 수를 동시에 계산할 수 있습니다.) 라벨링이 어려운 세포는 Incucyte^® Cytolight Rapid Red 또는 Incucyte^® Cytolight Rapid Green 시약을 사용하여 식별할 수 있습니다.
Incucyte^® 세포별 분석 소프트웨어 모듈(제품 번호 9600-0031)을 사용하면 표지된 표적 세포 집단과 표지되지 않은 효과기 세포 집단(증식 및 사멸) 모두를 정량화할 수 있습니다. 부착성 표적 세포의 경우, 이 소프트웨어를 통해 표적 세포가 존재하는 환경에서 효과기 세포 집단의 변화를 추적할 수 있습니다.

주요 장점

- 복합 공동 배양 환경에서 면역 세포와 암세포 간의 상호작용을 측정하고 관찰한다.
- 비침습적 시약과 직관적인 이미지 분석 도구를 사용하여 종양 또는 면역 세포의 증식 및 세포 사멸을 선택적으로 정량화합니다.
- 2D 또는 3D 환경에서 다양한 관련 면역 세포 및 종양 세포 공동 배양 모델을 평가합니다.
- 최적화된 시약과 프로토콜을 사용하여 96웰 또는 384웰 플레이트에서 면역 세포 사멸을 평가합니다. (세척, 세포 분리, 방사성 표지 불필요)

면역 세포와 암세포 간의 역동적인 상호작용을 관찰하고 정량화하여 복잡한 공동 배양 모델에서 세포 간 상호작용 및 면역 시냅스를 밝혀낸다.

(1) 작은 세포독성 T 세포와 더 큰 표지된 종양 세포(빨간색) 사이의 물리적 접촉. T 림프구 분열. (2) 세포독성 T 림프구의 공격을 받는 종양 세포: "죽음의 키스". (3) 종양 세포의 세포질 과립화 직후 카스파제 3/7 표지(녹색), 핵 응축 및 세포 사멸이 일어남. (4) 종양 세포의 유사분열: 하나의 세포가 두 개가 됨.

^® Cytolight Red로 염색된 A549 종양 세포를 Incucyte^® Fabfluor-488-α-CD45 및 Incucyte^® Opti-Green을 사용하여 전체 림프구 집단을 표지한 후, 사전 활성화 또는 비활성화된 PBMC와 혼합했습니다. PBMC 첨가 2시간 후의 이미지는 CD45+ 세포(녹색)와 A549 세포(빨간색) 사이의 상호작용을 보여줍니다. 상호작용 정량화(이미지의 노란색 마스크, 오버레이) 결과, 활성화된 효과기 세포와 표적 세포 간의 상호작용이 현저하게 증가하여 종양 세포에 대한 면역 사멸을 위한 세포 결합이 나타남을 보여줍니다(막대 그래프 참조). 이 분석은 Incucyte^® Cell-By-Cell Analysis 소프트웨어 모듈을 사용하여 수행되었습니다.

Incucyte^®의 직관적인 이미지 분석 도구와 비침습적인 시약을 사용하여 종양 세포의 생존력과 사멸 또는 면역 세포의 증식을 정량화하십시오.

Incucyte^®A549 세포에 Incucyte^® Nuclight NIR 렌티바이러스를 도입하고, 활성화된(상단 행) 또는 비활성화된(하단 행) PBMC를 다양한 농도로 첨가하여 Incucyte^® Annexin V Orange Reagent, Incucyte^® Fabfluor-488-α-CD45 항체 복합체 및 Incucyte^® Opti-Green 배경 억제제 존재 하에 공동 배양하였다. NIR(파란색) 핵의 정량은 표적 세포의 증식을 나타내고, 주황색 형광(Annexin V) 영역은 표적 세포의 사멸을 나타낸다. Incucyte^® Cell-by-Cell Analysis Software Module을 사용하여 종양 세포가 존재하는 환경에서 전체 이펙터 세포 수를 라벨 없이 정량화할 수 있다. Fabfluor-CD45를 첨가한 결과, 80% 이상이 CD45 양성 면역 세포임을 알 수 있다.

그림 2B. Incucyte를 사용하여 비부착성 표적 세포 및 효과기 세포의 증식, 사멸 및 하위 집단 분석을 측정합니다.^®세포 단위 분석 모듈. Ramos cells, transduced with Incucyte^® Nuclight Orange Lentivirus Reagent were co-cultured with activated or non-activated (using CD3/IL2) PBMCs in the presence of Incucyte^® Annexin V NIR Reagent, Incucyte^® Fabfluor-488-α-CD8 antibody complex and Incucyte^® Opti-Green background suppressor. Quantification of Orange (red) nuclei indicates target cell proliferation and area of NIR (blue) fluorescence the target cell death. Using Incucyte^® Cell-by-Cell Analysis Software Module total target and effector cell numbers, apoptotic index of target cells can be quantified and graphed over time.

말초혈액 단핵세포(PBMC), 세포독성 T 림프구, 자연살해 세포(NK 세포) 등 다양한 관련 모델을 부착성 또는 부유성 종양 세포와 함께 배양하여 평가합니다. T 세포 매개 세포독성(T 세포 매개 세포독성, ADCC) 및 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 실험에서 원하는 효과기 세포와 표적 세포를 선택하여 종양 스페로이드 모델에서 시간에 따른 면역 세포 사멸을 시각화하고 정량화합니다.

^®HER2 양성 SKOV-3 Nuclight Red 스페로이드(웰당 2.5K개)에 PBMC(웰당 6.25K개)를 접종하고 Herceptin(HER2 수용체를 표적으로 하는 단클론항체)으로 처리한 후 10일 동안 이미지를 촬영하였다(A). Herceptin에 의한 SKOV-3 스페로이드 성장 억제는 형광 강도를 통해 평가하였다(B).

PBMC를 SKOV-3 NucLight Red(HER2 양성) 또는 A549 NucLight Red(HER2 음성) 종양 세포와 함께 배양했습니다. SKOV-3 세포(A)에서는 트라스투주맙 농도 의존적 종양 세포 증식 억제가 관찰되었지만, A549 세포(B)에서는 억제되지 않았습니다. SKOV-3 세포에서 트라스투주맙의 증식 억제에 대한 농도-반응 곡선(C)을 나타냈습니다. 항체 존재 유무에 따른 처리되지 않은 이미지(상단)와 마스킹 처리된 이미지(하단)의 예시를 보여줍니다(첨가 후 72시간, D).

자동화된 이미지 및 분석 기능을 실험실에서 검증된 프로토콜과 결합하여 2D 또는 3D 공동 배양 모델에서 부착성 또는 비부착성 표적 종양 세포 모두에 적용하십시오.

일반적으로 사용되는 면역 세포 사멸 검사법

암세포에 대한 면역세포 사멸을 평가하는 데 사용되는 일반적인 방법은 대개 최종 결과 측정 방식이며, 세포를 분리하여 분석하는 방식(예: 유세포 분석)이나 종양 세포 생존력(예: LDH, GAPDH 방출 분석) 또는 면역세포 활성화(ELISpot)를 간접적으로 측정하는 방식입니다. 이러한 방법들은 일반적으로 영상 기반이 아닙니다. 아래 표는 몇 가지 일반적인 접근 방식의 장점과 한계를 보여줍니다.

	Incucyte 면역 세포 사멸 분석	유세포 분석	51 Cr 방출 분석	GAPDH/LDH 방출 분석	DELFIA^® TRF 분석	ELISpot	ADCC 리포터 생물학적 분석(프로메가)
실시간 세포 시각화
통합 분석
종양 세포 사멸의 직접 측정
종양 세포 생존력 측정
24시간 이상 장기 살균 효과 평가
표적 세포와 효과기 세포를 유연하게 선택할 수 있습니다.
ADCC 및 T 세포 사멸 형식
섞은 후 읽으세요, 씻지 마세요.
384웰 처리량
세포는 추가 분석에 사용될 수 있습니다.
높은 감도
비방사성
항체 표지 없음

암 면역요법 발견 - Incucyte^® 출판물

Griffiths, G.M. 외. J Clin Invest, 129(12):5600-5614, 2019

CD8 세포독성 T 림프구(CTL)는 분지형 F-액틴 네트워크의 빠른 재구성을 통해 용해성 과립의 편향된 분비를 유도하여 적응 면역 반응 동안 표적 세포 사멸을 시작합니다. Incucyte^® 생세포 분석 시스템을 사용하여 IL-2 결핍 후 장기간에 걸쳐 표적 세포 손실을 모니터링했습니다.

Adams, KJet al. . , AACR; 2014년 4월 5~9일, 캘리포니아주 샌디에고

인체 주요 장기를 대표하는 iPS 세포 배양 패널을 대상으로 T 세포의 비표적 활성을 테스트했습니다. Incucyte^® 시스템을 통해 4일 동안 실시간으로 카스파제-3/7 의존성 세포사멸을 직접 시각화할 수 있었습니다.

"ImmTAC에 의한 표적 사멸은 51Cr 방출 분석이나 장기 LDH 방출 분석과 같은 단기 사멸 분석에서 놓칠 수 있습니다. 따라서 Incucyte™ 기술의 적용 및 활용은 가능한 한 가장 엄격한 조건에서 ImmTAC의 효능과 특이성을 평가하는 데 매우 중요합니다."

Adams, K. (2013)

주문 정보

제품	수량	고양이. 아니요.
Incucyte^® 뉴클라이트 오렌지 렌티바이러스(puro) 2.0	0.6mL	BA-04891
Incucyte^® 뉴클라이트 레드 렌티바이러스(puro) 2.0	0.6mL	BA-04887
Incucyte^® 뉴클라이트 그린 렌티바이러스(puro) 2.0	0.6mL	BA-04888
Incucyte^® Nuclight Red Lentivirus (bleo) 2.0	0.6mL	BA-04889
Incucyte^® 뉴클라이트 그린 렌티바이러스(bleo) 2.0	0.6mL	BA-04890
Incucyte^® Nuclight NIR 렌티바이러스(puro)	0.2mL	4805
Incucyte^® 세포별 분석 소프트웨어 모듈	1모듈	9600-0031
IncucyteCaspase-3/7 녹색 시약^®	20 µl	4440
Incucyte^® 카스파제-3/7 적색 시약	20 µl	4704
Incucyte^® Annexin V Green Reagent	1 바이알	4642
Incucyte^® Annexin V 빨간색 시약	1 바이알	4641
Incucyte^® Annexin V 오렌지 시약	1 바이알	4759
Incucyte^® Annexin V NIR 시약	1 바이알	4768
Incucyte^® 사이토라이트 래피드 그린 시약	1병(15µg)	4705
Incucyte^® 사이토라이트 래피드 레드 시약	5개 바이알 x 50µg	4706
Incucyte^® 사이토라이트 래피드 오렌지 염료	1병(1mg)	4839
Incucyte^® 마우스 IgG2a Fabfluor-488 항체 표지 시약	1병(50µg)	4743
Incucyte^® 마우스 IgG2b Fabfluor-488 항체 표지 시약	1병(50µg)	4744
Incucyte^® 마우스 IgG1 FabFluor-488 항체 표지 시약	1병(50µg)	4745

자료

문헌 및 자료

브로셔

iQue와 Incucyte 워크플로우를 결합했습니다.

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자주 묻는 질문 (FAQ)

표적 세포에 원하는 형광물질을 미리 표지할 수 있나요?

네, 형광체의 여기 및 방출 스펙트럼이 Incucyte^® 형광 이미징 채널과 호환되는 한 가능합니다(기기 구성에 대한 기술 사양을 참조하십시오). 형광체 발현이 시간이 지남에 따라 불안정하거나 불균일한 표지가 발생하는 경우 데이터 품질이 저하될 수 있습니다. 장기간 생세포 연구에는 Incucyte^® Nuclight 렌티바이러스 표지 시약을 사용하는 것이 이상적입니다. 특히 형질전환이 어려운 표적 세포는 Incucyte^® Cytolight Rapid Green, Red 또는 Orange 염료를 사용하여 표지할 수도 있습니다.

미리 표지된 표적 세포를 사용해야 하나요?

부착성 종양 세포를 사용하는 경우 표적 세포를 미리 표지할 필요가 없습니다. 종양 세포 사멸은 Incucyte^® Caspase-3/7 염료 또는 Incucyte^® Annexin V 염료를 사용하여 검출하며, 이 염료는 처리 시약과 함께 분석 용액에 첨가하기만 하면 됩니다. 표적 세포를 표지할 필요는 없지만, Incucyte^® Nuclight 렌티바이러스 또는 Incucyte^® Cytolight 시약을 사용하여 종양 세포를 표지하면 생존 표적 세포 수를 실시간으로 동시에 측정할 수 있습니다. 부유성 표적 세포를 사용하는 경우에는 표적 세포를 미리 표지해야 합니다. 비부착성 종양 세포 사멸 측정은 시간에 따른 표적 세포 형광 감소량을 정량화하여 수행합니다. 부착성 세포와 부유성 세포 모두에서 세포별 분석을 수행하려면 표적 세포와 효과기 세포 모두를 표지해야 합니다.

Incucyte^® 세포별 분석 소프트웨어 모듈을 사용하여 이 분석에서 면역 세포 사멸 활성을 정량화할 수 있습니까?

예. 부착되지 않은 표적 세포 사멸을 측정할 때, 세포별 분석 소프트웨어 모듈을 사용하면 표지된 표적 세포 집단과 표지되지 않은 효과기 세포 집단의 특징(증식 및 사멸)을 모두 정량화할 수 있습니다. 부착된 표적 세포의 경우, 이 소프트웨어를 통해 표적 세포가 존재하는 환경에서 효과기 세포 집단의 변화를 추적할 수 있습니다.

상층액/효과 세포에 대해 유세포 분석 및 최종 시점 생화학적 측정을 수행하는 것이 가능합니까?

네. 분석이 완료되면 세포/상층액을 수확하여 원하는 추가 분석을 수행하면 됩니다. 이 분석법을 iQue T세포 활성화 키트(TCA)와 함께 사용하여 사이토카인 변화 및 효과기 세포의 활성화 상태를 파악하는 워크플로우 프로토콜이 마련되어 있습니다.

해당 분석법을 384웰 형식으로 소형화할 수 있을까요?

네. 저희는 384웰 플레이트 형식을 이용해 면역 세포 사멸 실험을 성공적으로 수행했습니다.