유세포 분석을 통한 고처리량 스크리닝(HTS)의 기초

유세포 분석법은 형광을 이용하여 세포의 물리적 및 생화학적 특성을 측정하는 강력한 기술입니다. 이 기술은 다음과 같은 이점을 제공합니다.

• 빠른 처리 속도: 초당 최대 수만 개의 입자를 처리할 수 있습니다.
• 단일 세포 또는 비드 분석: 개별 세포 또는 비드를 측정합니다.
• 다중 매개변수 측정: 하나의 세포에서 여러 매개변수를 동시에 분석하는 것.
• 풍부한 데이터: 수백만 개의 세포에 대한 정보를 수집합니다.

유세포 분석법은 형광을 이용하여 세포 및 세포 유사 입자의 내재적 및 외재적 물리적, 생화학적 특성을 측정하는 데 널리 사용되고 확립된 강력한 기술입니다. 이 기술은 개별 세포의 표면, 내부 또는 세포에서 생성되는 분석 물질을 신속하게 계수하고 측정하여 다양한 생물학적 특성 및 지표를 측정할 수 있도록 합니다.

유세포 분석 기초:

• 광산란 및 형광: 세포의 특성을 측정합니다.
• 기기 구성: 액체 속의 세포들이 튜브를 통해 일렬로 이동하며, 레이저와 검출기로 감지됩니다.
• 데이터 분석: 신호는 디지털 값으로 변환되어 컴퓨터 화면에 표시됩니다.

생물학적 세포나 입자는 빛을 산란시키는 능력을 가지고 있으며 고유한 형광을 발할 수 있습니다. 유세포 분석법은 이러한 특성을 이용하여 정성적 및 정량적 측정을 수행합니다. 항체와 같은 형광 표지자를 사용하면 단일 세포에서 다양한 세포 특징을 식별할 수 있습니다. 형광이란 특정 파장의 빛에 의해 여기된 후 더 긴 파장의 빛을 방출하는 현상입니다.

전방 산란, 측방 산란 또는 형광과 같은 검출기 측정값은 "매개변수"이며, 각 검출 가능한 개체와 해당 매개변수 값은 "이벤트"입니다. 형광 및 산란 신호는 전기 펄스를 생성하여 펄스 높이, 면적 및 너비와 같은 속성을 포착합니다. 원치 않는 잡음을 배제하기 위해 실행 시작 시 트리거와 임계값을 설정합니다. 게인(전압)은 노이즈에서 개체를 구분하기 위해 적용되며 신호 범위에 영향을 미칩니다. 초기 실행에서는 각 검출기의 게인을 조정합니다. 표지되지 않은 세포와 같은 음성 대조군을 항상 포함해야 합니다. FCS 파일이라고 하는 데이터 파일에는 매개변수 강도와 장비 설정이 저장되며 히스토그램 및 그래프와 같은 형식으로 시각화할 수 있습니다.

형광 연구에서 로그 증폭은 약한 신호를 확대하고 강한 신호를 압축하여 다양한 강도의 신호를 쉽게 표시할 수 있도록 합니다. 선형 스케일링은 세포 주기 분석과 같이 동적 범위가 낮은 신호에 더 적합합니다. 형광 염료, 항체, 단백질과 같은 다양한 도구를 사용하여 세포 분류 및 세포 사멸을 포함한 다양한 분석을 위한 분자 표지를 만들 수 있습니다. 일부 염료는 살아있는 세포에 침투하는 반면, 다른 염료는 손상된 세포에만 침투하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 구분할 수 있습니다.

탠덤 형광체는 결합된 형광체 사이에서 에너지를 전달함으로써 색상 분석 기능을 향상시킵니다. 형광 단백질은 단백질 발현을 나타내며, 양자점은 더 좁은 발광 피크를 제공합니다. 다색 형광은 복잡한 집단의 분석을 가능하게 하며, 형광체의 수는 레이저와 검출기에 따라 달라집니다.

표지된 물질에서 발생하는 형광은 배경 검출 수준을 설정하여 집중적으로 분석할 수 있습니다. 스펙트럼이 겹치면 감도가 저하될 수 있지만, 추가 레이저를 사용하면 신호 해상도를 향상시킬 수 있습니다. 보정 과정에서는 원치 않는 신호를 제거하기 위해 제어 신호를 사용하여 형광 스필오버를 보정합니다. 염색 최적화는 배양 시간 및 염료 대 표지 물질 비율과 같은 요소를 고려하여 매우 중요합니다. 적절한 해상도를 얻으려면 충분한 양의 염료가 필요하며, 이는 신호 대 잡음비를 최대화하기 위해 적정을 통해 확보합니다.

시료는 단일 세포 현탁액 형태로 제공되는 것이 중요합니다. 이를 위해 기계적 분리 및 박리, 효소 용액 또는 칼슘 킬레이션과 같은 방법이 일반적으로 사용됩니다. 항체 희석 및 완충액 세척은 비특이적 결합을 방지합니다. 시료 현탁액은 1차 및 2차 항체, 스트렙타비딘, 형광 염료 등의 성분과 함께 배양됩니다. 형광 염료의 양이 알려진 공시료 및 대조 시료를 시험 시료와 함께 사용하여 유속과 전압을 최적화합니다.

유세포 분석용 비드는 품질 관리, 표준화 및 보정을 통해 분석 과정을 개선하는 데 사용되는 비생물학적 미세구체입니다. 이 비드는 기기 정렬의 변동을 줄여 데이터의 정확성, 신뢰성 및 재현성을 향상시킵니다.

• 품질 관리 비드는 교정, 보정 및 계수에 사용되어 기기가 사양을 충족하는지 확인합니다.
• 보정 비드는 특히 자동 보정 기능이 없는 경우 다색 패널에서 형광 번짐을 최소화합니다.
• 계수 비드는 비드 수와 세포 수를 비교하여 입자 농도를 계산하는 데 도움을 주며, 정확한 세포 수를 제공합니다. 비드는 세포 용해, 염색 및 세척 후에 첨가됩니다. 정확한 양의 비드를 알려진 양의 세포 시료와 혼합하고, 각 비드의 비율을 이용하여 세포 수를 결정합니다.

유세포 분석법은 검출기 신호를 이용하여 SSC, 형광 또는 FSC에 대한 펄스 피크를 생성하고, 이를 "점도"로 시각화합니다. 게이팅은 세포 하위 집단을 분리하고 사멸 세포 및 세포 파편과 같은 불필요한 이벤트를 제거하는 데 중요한 도구입니다. 적절한 게이팅은 데이터 정확도를 향상시킵니다.

• 전기 신호를 점도표, 히스토그램, 히트맵, 클러스터 다이어그램과 같은 시각화 자료로 변환하여 해석을 돕는 것이 핵심입니다. '점도표'는 유체 흐름 경로를 통과하는 생물체의 피크 면적 또는 피크 높이를 그래프로 시각화한 것입니다. 각 점은 유세포에서 발생하는 하나의 이벤트를 나타내므로 하나의 그래프에 수백만 개의 개체를 시각화할 수 있습니다.
• 전통적인 유세포 분석 방법은 "게이팅"을 이용하는 것입니다. 공통적인 특성(일반적으로 전방 산란, 측방 산란 및 마커 발현)을 가진 세포 집단 주변에 게이트와 영역을 설정하여 관심 있는 세포 집단을 조사하고 정량화합니다.
• 두 생물체가 서로 붙어 있거나 유세포 분석기를 너무 가까이 통과하면, 단일 세포일 때보다 피크 면적과 폭이 모두 커집니다. 단일체 게이트를 사용하면 피크 높이 증가 없이 피크 면적만 증가하는 생물체를 제거할 수 있습니다. 이중체 이벤트는 특정 생물체에 대해 인위적으로 높은 형광 결과를 초래할 수 있으므로 이를 제거하는 것이 중요합니다.

고처리량 스크리닝(HTS)은 최소한의 분석 용량을 사용하므로 비용이 절감되며, 일반적으로 96웰 또는 384웰 마이크로플레이트에서 방대한 수의 샘플을 스크리닝하는 데 이상적입니다. HTS 스크리닝은 일반적으로 조사해야 할 매개변수는 적지만 샘플 크기는 훨씬 더 큽니다.

자동화는 다음과 같은 다양한 측면에서 유익합니다.

• 시료 및 시약 첨가, 혼합, 배양 및 검출을 위한 분석용 마이크로플레이트 운반용 로봇 팔을 포함한 완전 통합 자동화 시스템.
• 또는 무인 분석을 지원하는 더 간단한 플레이트 로딩 장비.

iQue^® HTS 유세포 분석기는 강력한 통합 iQue Forecyt^® 소프트웨어의 지원을 받아 HTS에 적합한 속도와 사용 편의성을 갖춘 다중 매개변수 세포 및 비드 분석의 완벽한 조합을 제공합니다. iQue^® 플랫폼의 핵심 차별점은 에어갭 기술로, 96웰 플레이트 전체를 5분 만에 연속적으로 수집 및 분석할 수 있다는 점입니다.