개요

표지 시약으로 인해 발생할 수 있는 인공물을 줄여 통합된 이미지 획득 및 분석을 통해 생존 대 사멸 또는 분화 상태를 식별하여 생물학적 통찰력 개선.

라벨 없는 생존/사멸 분석은 Incucyte^® Annexin V 시약 존재 하에 캄프토테신(CMP, 0.1 – 10 µM), 스타우로스포린(STP, 1 – 1000 nM), 시스플라틴(CIS, 0.5 – 50 µM)의 농도 범위로 처리하여 다양한 형태를 가진 6가지 세포 유형에서 수행되었습니다. 이미지는 Incucyte^® 부착 세포 단위 분석 소프트웨어 모듈을 사용하여 획득 및 분할되었으며, 사멸 세포는 고급 라벨 없는 분류 및 형광 분류(Annexin V)를 사용하여 정량화되었습니다. 이미지는 CMP로 처리된 A549 세포, STP로 처리된 HeLa 세포, CIS로 처리된 HT1080 세포의 생존 및 사멸 형태를 보여줍니다. 고급 라벨 없는 분류 시간 경과는 72시간 동안 사멸 세포의 % 증가를, Annexin V 시간 경과는 72시간 동안 Annexin V 양성 세포의 % 증가를 보여줍니다. 두 방법의 시간 경과 및 농도 반응 곡선은 비교 가능합니다.

세포 분화의 라벨 프리 분류를 위한 강력하고 목적에 맞는 소프트웨어를 사용하여 반복 가능한 실험 결과를 달성하세요.

라벨 프리 분화 분석은 PMA(100 nM)를 사용하여 대식세포 표현형으로 분화된 THP-1 단핵구에서 수행되었으며, Fabfluor-488로 표지된 CD11b(대식세포 마커)가 존재합니다. 이미지는 Incucyte^® 부착 세포 단위 분석 소프트웨어 모듈을 사용하여 획득 및 분절되었으며, 대식세포는 고급 라벨 프리 분류와 형광 분류(CD11b) 모두를 사용하여 정량화되었습니다. 위상 HD 및 형광 혼합 이미지는 단핵구에서 대식세포로 분화하면서 형태 변화와 CD11b 발현(녹색 형광) 증가를 보여줍니다. 대식세포 비율의 시간 경과는 형태학적 변화가 CD11b 상향 조절보다 약간 앞서 시간에 따라 분화된 세포의 증가를 보여줍니다(0 - 24시간). 분화는 두 방법 모두 최대 80% 대식세포 집단으로 48시간 후 정체됩니다.

96- 및 384-웰 형식에서 이미지 기반 세포 형태학 분석을 위해 머신 러닝을 활용하여 상당한 처리량을 잠금 해제합니다.

고급 라벨 프리 분류는 세포 독성 작용제를 식별하는 데 사용되었습니다. 세포는 사멸을 유도하는 것으로 알려진 CMP(10 µM)를 사멸 대조군으로 포함하여 다양한 작용 메커니즘을 가진 14개 화합물로 96-웰 스크린에서 처리되었습니다. 사멸된 세포의 %는 고급 라벨 프리 분류를 사용하여 정량화되었습니다. 96-웰 플레이트의 심층 보기는 처리 후 72시간에 라이브(녹색) 및 사멸(빨간색) 분류 마스크를 보여주어 사용자에게 어떤 화합물과 농도가 세포 독성인지 신속한 개요를 제공합니다.

A549 세포를 CMP의 농도 범위(0.1 – 10 µM)로 처리하여 세포 사멸을 유도했습니다. 총 형태의 고급 라벨 없는 분류(다변량 분석, 왼쪽) 또는 세포 원형도를 설명하는 단일 지표(단변량 분석, 오른쪽)를 사용하여 % 사멸 세포를 정량화했습니다. 시간 경과는 각 방법에 대한 시간에 따른 % 사멸 세포를 보여줍니다. 고급 라벨 없는 분류는 예상되는 시간 및 농도 의존적 세포 사멸 증가를 나타내며, 이 시간 경과는 Annexin V 검증 연구와 비교할 수 있습니다. 세포 원형도의 단변량 분석은 72시간에 농도 의존적 % 사멸 세포 증가를 보여주지만, 용매는 시간에 따라 변화하는 높은 수준의 세포 사멸을 나타냅니다. 이 데이터는 이미지의 시각적 분석에 의해 뒷받침되지 않습니다.

형광 시약 유무에 관계없이 여러 세포 유형에서 수행된 Live/Dead 및 분화 분석, Incucyte^® 세포별 또는 고급 레이블 없는 형태학적 분석을 사용하여 결과 검증. Incucyte^® 고급 레이블 없는 분류 분석에서 생성된 레이블 없는 데이터는 형광 시약 및 분석 사용과 비교하여 동등하고 재현 가능한 결과를 확인했습니다.

윤곽선은 세포 분할을 나타내고 색상은 클래스를 나타냅니다 (빨간색 = 죽은 세포, 자홍색 = 생존 분지상, 청록색 = 생존 아메보이드). iPSC 유래 미세아교세포를 96웰 플레이트에 12K 세포/웰로 파종했습니다. 세포는 정기적인 배지 교체와 함께 특정 미세아교세포 배지에서 유지되었습니다. 배양은 Incucyte^®에서 모니터링되었고, Incucyte^® AI 세포 건강 분석을 사용하여 생존율을 정량화했습니다. 생존 가능한 세포 집단의 특성은 고급 무표지 분류를 사용하여 수행되었으며, 분지상(휴지) 형태의 세포 비율과 아메보이드(활성화) 형태의 세포 비율을 결정했습니다. 세포는 주로 휴지 상태를 유지했지만, 배양 48시간 후 생존율이 급격히 떨어졌습니다.